雞堆型艾美耳球蟲Rhomboid增強(qiáng)型核酸疫苗構(gòu)建及免疫保護(hù)作用.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳球蟲屬7種球蟲引起的腸道寄生蟲疾病，其中堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）是其主要病原之一。雞球蟲子孢子入侵到腸道上皮細(xì)胞并增殖使其嚴(yán)重受損從而導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低、增重降低，這給養(yǎng)禽生產(chǎn)業(yè)造成極大的損失。過(guò)去，雞球蟲病主要靠藥物防治，但是由此引發(fā)球蟲耐藥株的產(chǎn)生和藥物殘留等嚴(yán)重問(wèn)題，現(xiàn)在球蟲疫苗免疫防治逐漸替代藥物防治，其中篩選有效的免疫抗原是制備高效新型球蟲疫苗的基礎(chǔ)和關(guān)

2、鍵。Rhomboid屬于廣泛分布的絲氨酸蛋白酶家族，在球蟲發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中執(zhí)行各種各樣功能，特別是在球蟲入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可能是其潛在的免疫性抗原。
　　根據(jù)GenBank柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid基因序列(DQ323509.1)設(shè)計(jì)特異性引物，以堆型艾美耳球蟲cDNA為模板PCR擴(kuò)增包含Rhomboid基因ORF片段?？乖砦环治龊笤O(shè)計(jì)表達(dá)區(qū)域特異性引物，PCR擴(kuò)增后連接于pG EX-6p-1原核表達(dá)載體并成功構(gòu)建

3、重組質(zhì)粒pGEX-Rhomboid。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE顯示有36 ku預(yù)期蛋白表達(dá)。純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗Rhomboid多抗。ELISA檢測(cè)多抗效價(jià)達(dá)216，Western-blot檢測(cè)表明制備的多抗具有良好的反應(yīng)性和特異性。
　　本試驗(yàn)同時(shí)構(gòu)建pcDNA-Rhomboid及pcDNA-I FN-γ-Rhomboid重組真核表達(dá)質(zhì)粒，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表明Rhom

4、boid及IFN-γ均可在BH K21細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可用作免疫動(dòng)物DNA疫苗使用。試驗(yàn)雛雞分為5組，分別為兩個(gè)真核質(zhì)粒免疫組即pcDNA-Rhomboid質(zhì)粒免疫組(Rho組)和pcDNA-IFN-γ-Rhomboid質(zhì)粒免疫組（IFN-γ-Rho組），兩個(gè)攻蟲對(duì)照組即PBS注射攻蟲組（PBS組）和pcDNA3.1空白質(zhì)粒注射組（pcDNA組）和不攻蟲對(duì)照組（Control組）。在14及21日齡時(shí)，除Control組每只雞分別胸部肌肉注射

5、100μL PBS或100μg pcDNA3.1、pcDNA-Rhomboid或pcDNA-IFN-γ-Rhomboid，在28日齡時(shí)，感染組雛雞口服接種孢子化卵囊1×105個(gè)。分別在14、21、28、35及42日齡時(shí)，檢測(cè)每組雛雞淋巴細(xì)胞增殖功能、血清中抗Rhomboid IgG抗體變化及體增重變化，35日齡時(shí)，檢測(cè)各組的十二指腸病變計(jì)分、克糞便卵囊數(shù)量(OPG)值并計(jì)算抗球蟲指數(shù)(ACI)。結(jié)果表明，Rho組與IFN-γ-Rho組的