堆型艾美耳球蟲單鏈抗體-PE40重組毒素構(gòu)建及活性研究.pdf

1、球蟲病是一種全球性的原蟲病，它是集約化養(yǎng)雞業(yè)最為常見、多發(fā)、且危害嚴(yán)重的疾病之一。多年來，該病防治主要依靠藥物，但因抗藥蟲株不斷涌現(xiàn)以及藥物殘留等問題，利用免疫預(yù)防來取代藥物控制球蟲病已成為人們的共識(shí)。免疫毒素是一種導(dǎo)向藥物，將堆型艾美耳球蟲單鏈抗體基因與綠膿桿菌外毒素PE40基因連接，裝入表達(dá)載體pET-22(b)+中，以獲得重組毒素，研究其對(duì)堆型艾美耳球蟲的殺滅作用。將含外毒素的綠膿桿菌ATCC27853培養(yǎng)上清2ml接種21日齡的

2、健康公雛雞，接種后18～40小時(shí)內(nèi)小雞全部死亡，顯示其具有作為免疫毒素彈頭的潛力。根據(jù)GeneBank發(fā)表的綠膿桿菌外毒素基因全序列，設(shè)計(jì)引物，引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。采用PCR方法擴(kuò)增PE40基因，純化PCR產(chǎn)物與pMD18-Tsimple載體連接構(gòu)建質(zhì)粒pT-PE40，藍(lán)白斑篩選陽性克隆。質(zhì)粒pT-PE40經(jīng)HindⅢ酶切顯示2692bp和1101bp兩條帶。與PA103相比，質(zhì)粒pT-pE40的測(cè)序結(jié)果顯示ATCC27853的PE

3、40肽段的重要活性位點(diǎn)均與PA103相同。 含ScFv基因的質(zhì)粒pET22-ScFv已經(jīng)構(gòu)建，用HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pT-PE40和pET22-ScFv分別進(jìn)行雙酶切，利用HindⅢ酶切位點(diǎn)將PE40基因亞克隆到pET22-ScFv載體上構(gòu)建融合毒素pET22-ScFv-PE40。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109宿主菌。轉(zhuǎn)化菌液涂于含氨芐青霉素(50ug/ml)LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，挑選菌落分別接種于含氨芐青霉素(50ug/m1)的LB

4、培養(yǎng)液中，用SalⅠ和NotⅠ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1114bp和6181bp目的基因片段。測(cè)序鑒定插入方向，選取以PE40基因5’端與ScFv基因3’端連接的重組質(zhì)粒pET22-ScFv-PE40。 抗堆型艾美耳球蟲重組質(zhì)粒pET22-ScFv-PE40經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)，成功地表達(dá)約68KD的目的蛋自。表達(dá)產(chǎn)物以可溶形式存在于上清中。使用抗PE多克隆抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行蛋白印跡分析，表達(dá)產(chǎn)物與抗PE多克隆抗