雞堆型艾美爾球蟲免疫增強(qiáng)型核酸疫苗構(gòu)建及其免疫效應(yīng).pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由一種以腸道病變?yōu)橹鞯募纳x病,給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前雞球蟲病主要以藥物防治為主,但由于藥物殘留和耐藥性問題,使得一些藥物難以發(fā)揮其有效的療效。球蟲疫苗的研究,特別是新型球蟲核酸疫苗研究,逐漸成為球蟲病防治研究的新焦點(diǎn)。
　　 本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的堆型艾美爾球蟲(E.acervulina)EalA基因序列設(shè)計引物,成功克隆上海株堆型艾美爾球蟲的部分EalA基因,大小為1256bp。同時

2、構(gòu)建EalA和ChIL-18的原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)大小分別為51Kda和26Kda的EalA和ChIL-18蛋白,利用鎳離子親和樹脂純化后免疫新西蘭白兔,制備兔抗EalA和ChIL-18多克隆抗體。經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)和Westernblot證明制備的多克隆抗體均具有良好的反應(yīng)性。
　　 本研究利用一段編碼(G4S)3多肽的堿基linker序列將3-1E與EalA基因進(jìn)行連接,成功構(gòu)建了一個融合基因真核表達(dá)載體質(zhì)粒,即PVAX-3-

3、1E-linker-EalA質(zhì)粒。融合基因質(zhì)粒體外瞬時轉(zhuǎn)染和體內(nèi)接種試驗(yàn)表明表達(dá)的融合蛋白可以被EalA多克隆抗體和3-1E多克隆抗體檢測出來,進(jìn)一步證明了融合基因表達(dá)的蛋白具有兩段基因各自的生物活性,為后續(xù)動物免疫試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。
　　 動物免疫試驗(yàn)分為7個組,即PBS組(PBS對照組)、PVAX組(PVAX空質(zhì)粒免疫組)、IL-18組(PVAX-IL-18真核質(zhì)粒免疫組)、3-1E組(PVAX-3-1E真核質(zhì)粒免疫組)、

4、EalA組(PVAX-EalA真核質(zhì)粒免疫組)、LK組(PVAX-3-1E-linker-EalA融合基因真核質(zhì)粒免疫組),以及LK+組(PVAX-3-1E-linker-EalA融合基因真核質(zhì)粒和PVAX-IL-18真核質(zhì)粒免疫組)。利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫器官指數(shù)對不同處理組雛雞的各項(xiàng)免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測,評價真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫效應(yīng)。結(jié)果表明,5組疫苗免疫組各日齡雛雞的免疫指標(biāo)均高于組對照組,其中有ChIL-18、L

5、K、LK+三組免疫組免疫應(yīng)答反應(yīng)尤為突出。其中T、B淋巴細(xì)胞增殖功能、外周血液中抗3-1E和EalA特異性抗體水平以及免疫器官指數(shù)與對照組相比較都有明顯的提高,而且以LK+組最為顯著。
　　 綜上所述,3-1E與EalA融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒不但能刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,而且能夠刺激機(jī)體體液免疫應(yīng)答,ChIL-18基因可以提高3-1E與EalA融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答能力,進(jìn)而提高機(jī)體抵抗球蟲攻擊