野生大豆GsMIPS2和GsSNAP33基因在鹽堿脅迫下的功能分析.pdf

1、鹽堿脅迫是制約植物生長和繁殖的環(huán)境因素之一，因此培育具有耐鹽堿功能的作物具有重要意義。一般情況下，鹽堿脅迫主要破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的滲透平衡和離子平衡。眾所周知，脅迫信號首先通過細(xì)胞膜上的受體感知，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中激活脅迫應(yīng)答基因，用于調(diào)節(jié)植物的抗逆性。因此，了解參與脅迫應(yīng)答基因的耐鹽堿分子機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路對作物改良具有重大意義。
　　野生大豆(Glycine soja)較于經(jīng)過人類長期馴化的其它豆類作物具有更好的適應(yīng)能力和抗逆

2、性，因此，被認(rèn)為是挖掘和克隆脅迫抗性基因的重要供體材料。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)完成對野生大豆G07256鹽堿脅迫(NaHCO3)下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析。本研究通過生物信息學(xué)方法從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出兩個(gè)可能響應(yīng)鹽堿脅迫的候選基因GsMIPS2和GsSNAP33，通過分析GsMIPS2超表達(dá)和基因沉默突變體擬南芥植株不同生長階段鹽脅迫下的表型，測定脅迫相關(guān)生理指標(biāo)（MDA,葉綠素含量，電解質(zhì)外滲），并分析鹽堿脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)量，對GsMIPS2基

3、因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，GsMIPS2基因通過保護(hù)光合作用系統(tǒng)，穩(wěn)定脅迫傷害和提高脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。同時(shí)，本研究克隆了GsSNAP33基因的全長序列并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，表達(dá)模式分析和亞細(xì)胞定位分析，并通過在擬南芥中超量表達(dá)進(jìn)行了初步的功能和機(jī)理研究。本研究將增加對植物耐鹽堿分子機(jī)理的理解，并為培育耐鹽堿作物提供重要的基因資源，同時(shí)也為闡明植物抗逆機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。結(jié)果簡要總結(jié)如下:

4、>　　1.野生大豆鹽堿脅迫應(yīng)答基因(GsSNAP33和GsMIPS2)的克隆和序列分析
　　本研究通過同源克隆方法從野生大豆中克隆鹽堿脅迫應(yīng)答基因GsSNAP33的全長CDS區(qū)。GsSNAP33含有由903堿基組成的開放閱讀框(ORF)，編碼300個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，蛋白分子量為33，311Da。GsMIPS2含有1533堿基組成的開放閱讀框(ORF)，編碼510個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，蛋白分子量為56，445Da。序列分析揭示G

5、sSNAP33基因含有兩個(gè)保守序列，一是Qb/Qc的亞家族成員的N-末端序列，二是Qc亞家族的的SNARE序列。同樣，GsMIPS2序列分析表明四個(gè)高度保守序列GWGGNNG/LWTANTERY/NGSPQNTFVPG和SYNHLGNNDG的存在。
　　2.鹽堿脅迫應(yīng)答基因GsMIPS2和GsSNAP33基因表達(dá)模式的分析
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析GsMIPS2基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示GsMIPS2基

6、因能夠被鹽堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測GsMIPS2基因可能參與鹽堿脅迫信號傳導(dǎo)途徑。而GsSSNAP33基因受中性鹽、蘇打鹽、ABA、PEG誘導(dǎo)表達(dá)，且在脅迫條件下，GsSNAP33基因在根中的表達(dá)量顯著高于葉中，在中性鹽和ABA脅迫下的表達(dá)量高于蘇打鹽或者PEG脅迫,表明GsSNAP33基因可能也參與鹽堿脅迫應(yīng)答。此外，組織定位分析表明GsSNAP33基因在種莢、根和種子中表達(dá)量較高，而在莖，葉和花中表達(dá)量較低。
　　3.GsSNAP

7、33蛋白的亞細(xì)胞定位
　　本研究用綠色熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)檢測GsSNAP33蛋白的亞細(xì)胞定位情況。構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體PBSKⅡ-GsSNAP33-eGFP,并通過基因槍轟擊法將融合載體在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。GsSNAP33蛋白被發(fā)現(xiàn)定位在質(zhì)膜上，可能在脅迫相關(guān)的信號傳遞過程中具有重要的作用。
　　4.超量表達(dá)GsMIPS2基因在擬南芥中提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥不同的生長階段的耐鹽性
　　本研究采用GsMI

8、PS2轉(zhuǎn)基因株系，mips2突變體和野生型擬南芥進(jìn)行表型分析。通過研究不同生長階段，包括萌發(fā)期、幼苗期和成苗期各個(gè)擬南芥株系的耐鹽性來闡明GsMIPS2基因的功能。研究結(jié)果表明，與野生型和突變體植株相比，GsMIPS2轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下萌發(fā)率、根長、葉綠素含量顯著增加，而MDA含量和電解質(zhì)外滲水平顯著降低，這表明GsMIPS2轉(zhuǎn)基因株系提高了植物對鹽脅迫的耐受性。
　　5.分析了鹽堿脅迫響應(yīng)基因在野生型和超表達(dá)擬南芥植株中的表達(dá)