野生大豆GsMIPS2和GsSNAP33基因在鹽堿脅迫下的功能分析.pdf

1、鹽堿脅迫是制約植物生長和繁殖的環(huán)境因素之一，因此培育具有耐鹽堿功能的作物具有重要意義。一般情況下，鹽堿脅迫主要破壞細胞內(nèi)環(huán)境的滲透平衡和離子平衡。眾所周知，脅迫信號首先通過細胞膜上的受體感知，然后進一步轉(zhuǎn)導至細胞中激活脅迫應答基因，用于調(diào)節(jié)植物的抗逆性。因此，了解參與脅迫應答基因的耐鹽堿分子機制和信號傳導通路對作物改良具有重大意義。
　　野生大豆(Glycine soja)較于經(jīng)過人類長期馴化的其它豆類作物具有更好的適應能力和抗逆

2、性，因此，被認為是挖掘和克隆脅迫抗性基因的重要供體材料。本實驗室前期已經(jīng)完成對野生大豆G07256鹽堿脅迫(NaHCO3)下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析。本研究通過生物信息學方法從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出兩個可能響應鹽堿脅迫的候選基因GsMIPS2和GsSNAP33，通過分析GsMIPS2超表達和基因沉默突變體擬南芥植株不同生長階段鹽脅迫下的表型，測定脅迫相關生理指標（MDA,葉綠素含量，電解質(zhì)外滲），并分析鹽堿脅迫下相關基因的表達量，對GsMIPS2基

3、因的功能進行驗證。結(jié)果表明，GsMIPS2基因通過保護光合作用系統(tǒng)，穩(wěn)定脅迫傷害和提高脅迫響應基因的表達量增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。同時，本研究克隆了GsSNAP33基因的全長序列并對其進行了生物信息學分析，表達模式分析和亞細胞定位分析，并通過在擬南芥中超量表達進行了初步的功能和機理研究。本研究將增加對植物耐鹽堿分子機理的理解，并為培育耐鹽堿作物提供重要的基因資源，同時也為闡明植物抗逆機制提供了重要的理論基礎。結(jié)果簡要總結(jié)如下:

4、>　　1.野生大豆鹽堿脅迫應答基因(GsSNAP33和GsMIPS2)的克隆和序列分析
　　本研究通過同源克隆方法從野生大豆中克隆鹽堿脅迫應答基因GsSNAP33的全長CDS區(qū)。GsSNAP33含有由903堿基組成的開放閱讀框(ORF)，編碼300個氨基酸組成的多肽鏈，蛋白分子量為33，311Da。GsMIPS2含有1533堿基組成的開放閱讀框(ORF)，編碼510個氨基酸組成的多肽鏈，蛋白分子量為56，445Da。序列分析揭示G

5、sSNAP33基因含有兩個保守序列，一是Qb/Qc的亞家族成員的N-末端序列，二是Qc亞家族的的SNARE序列。同樣，GsMIPS2序列分析表明四個高度保守序列GWGGNNG/LWTANTERY/NGSPQNTFVPG和SYNHLGNNDG的存在。
　　2.鹽堿脅迫應答基因GsMIPS2和GsSNAP33基因表達模式的分析
　　通過實時熒光定量PCR實驗分析GsMIPS2基因在鹽脅迫條件下的表達模式，結(jié)果顯示GsMIPS2基

6、因能夠被鹽堿脅迫誘導表達，推測GsMIPS2基因可能參與鹽堿脅迫信號傳導途徑。而GsSSNAP33基因受中性鹽、蘇打鹽、ABA、PEG誘導表達，且在脅迫條件下，GsSNAP33基因在根中的表達量顯著高于葉中，在中性鹽和ABA脅迫下的表達量高于蘇打鹽或者PEG脅迫,表明GsSNAP33基因可能也參與鹽堿脅迫應答。此外，組織定位分析表明GsSNAP33基因在種莢、根和種子中表達量較高，而在莖，葉和花中表達量較低。
　　3.GsSNAP

7、33蛋白的亞細胞定位
　　本研究用綠色熒光蛋白表達系統(tǒng)檢測GsSNAP33蛋白的亞細胞定位情況。構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白的融合表達載體PBSKⅡ-GsSNAP33-eGFP,并通過基因槍轟擊法將融合載體在洋蔥表皮細胞中瞬時表達。GsSNAP33蛋白被發(fā)現(xiàn)定位在質(zhì)膜上，可能在脅迫相關的信號傳遞過程中具有重要的作用。
　　4.超量表達GsMIPS2基因在擬南芥中提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥不同的生長階段的耐鹽性
　　本研究采用GsMI

8、PS2轉(zhuǎn)基因株系，mips2突變體和野生型擬南芥進行表型分析。通過研究不同生長階段，包括萌發(fā)期、幼苗期和成苗期各個擬南芥株系的耐鹽性來闡明GsMIPS2基因的功能。研究結(jié)果表明，與野生型和突變體植株相比，GsMIPS2轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下萌發(fā)率、根長、葉綠素含量顯著增加，而MDA含量和電解質(zhì)外滲水平顯著降低，這表明GsMIPS2轉(zhuǎn)基因株系提高了植物對鹽脅迫的耐受性。
　　5.分析了鹽堿脅迫響應基因在野生型和超表達擬南芥植株中的表達