腎上腺髓質(zhì)素抑制劑ADM22-52對高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,最終會導(dǎo)致患者視力的下降乃至失明。早期的臨床表現(xiàn)主要為:眼底微血管瘤和出血點(diǎn),進(jìn)而血管扭曲、擴(kuò)張,視網(wǎng)膜血管狹窄導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血,最終形成新生血管。增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Proliferative diabetic retinopathy,PDR)的一個重要標(biāo)志是眼底新生血管的形成,近年來,隨著DR

2、患病率的不斷升高,DR已成為50歲以上患者致盲的主要原因。腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin,ADM)是一種具有多種生物活性的多肽,廣泛參與機(jī)體活動。有研究表明,其在新生血管的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。但是,目前對腎上腺髓質(zhì)素的研究還主要集中在腫瘤方面,對眼部新生血管作用的研究甚少。本研究旨在探討腎上腺髓質(zhì)素抑制劑(Adrenomedullin22-52,ADM22-52)對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制。在

3、體外實(shí)驗(yàn)中,分別運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和管腔形成實(shí)驗(yàn)來探討ADM22-52對高糖狀態(tài)下人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移和血管網(wǎng)形成的影響并探討其可能的作用機(jī)制。明確ADM22-52對高糖狀態(tài)下人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響,可能會為臨床治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變(視網(wǎng)膜新生血管)提供一定的依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.將HRECs分成三組,加入不同濃度的糖溶液(5mM,15mM,30mM)干預(yù)24h后抽提細(xì)胞RNA,檢

4、測不同糖濃度對ADM表達(dá)的影響。
　　2.將細(xì)胞分成4組(5mM,30mM,30mM+100ng/ml ADM22-52,30mM+1000ng/ml ADM22-52),均勻加入到6孔板內(nèi),待細(xì)胞鋪滿板底后,無菌黃槍尖垂直板底進(jìn)行劃痕,去除漂浮的細(xì)胞后,加入含不同濃度糖和ADM22-52的無血清培養(yǎng)基,于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并于0h、12h、24h拍照,Photoshop CS2軟件計(jì)算遷移距離。
　　3.將

5、細(xì)胞分成5組(5mM,30mM,30mM+10ng/ml ADM22-52,30mM+100ng/ml ADM22-52,30mM+1000ng/ml ADM22-52),將細(xì)胞加入96孔板內(nèi),每孔約4000細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁,饑餓處理24h后,加入不同糖及ADM22-52藥物濃度干預(yù)24h后,每孔加入CCK-810μl,37℃培養(yǎng)箱放置2到4h,酶聯(lián)儀檢測每孔內(nèi)450nm波長的吸光度(OD值),記錄并分析。
　　4.將1.5×10

6、4細(xì)胞以及糖和藥物ADM22-52加入到含Matrigel基質(zhì)膠的96孔板內(nèi),培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h后拍照,管腔數(shù)目統(tǒng)計(jì)并分析。
　　5.在糖和藥物ADM22-52處理細(xì)胞8h后,抽提RNA,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測VEGF、TSP-1、ADAMTS-1的表達(dá)。
　　6.在糖和藥物ADM22-52處理細(xì)胞24h后,抽取細(xì)胞蛋白,運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測VEGF、PI3K蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.RT

7、-PCR結(jié)果顯示,與5mM糖濃度相比,30mM的糖濃度能夠促進(jìn)細(xì)胞ADM和VEGF的表達(dá)(P<0.05)。
　　2.與正常糖濃度相比,高糖能明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移和管腔形成,同時這種作用能夠被ADM22-52所阻斷(P<0.05)。
　　3.CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示1000ng/ml的ADM22-52能夠抑制細(xì)胞的增殖,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而糖濃度的變化對細(xì)胞的增殖無明顯差異(P>0.05)。
　　4.RT-PC

8、R結(jié)果顯示,5μg/ml的ADM22-52能夠抑制高糖誘導(dǎo)的VEGF基因的表達(dá),促進(jìn)ADAMTS-1的表達(dá)(P<0.05)。
　　5.Western blot結(jié)果顯示,5μg/ml ADM22-52能夠抑制VEGF、PI3K蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖能夠促進(jìn)HRECs的遷移以及管腔形成;促進(jìn)其ADM,VEGF基因的表達(dá);
　　2.ADM22-52對HRECs的遷移、增