馬兜鈴酸對腎臟管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、背景和目的:
　　馬兜鈴酸(Aristolochic Acid,AA)隸屬于馬兜鈴屬,長期服用 AA或含 AA的藥物可引起患者腎小管壞死,腎間質(zhì)明顯纖維化,進(jìn)而發(fā)展為慢性腎功能衰竭,由此,國內(nèi)外學(xué)者將這類腎臟疾病稱之為馬兜鈴酸腎病(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN)[1]。與其他腎臟疾病或中毒性腎病不同,AAN患者表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,缺乏明顯的上皮細(xì)胞再生,基底膜裸露,間質(zhì)彌漫

2、性增寬、進(jìn)行性纖維化。目前,這些特殊損傷病理表現(xiàn)機(jī)制尚不十分清楚,臨床治療更無有效措施, AAN患者常病情遷延不愈,最終進(jìn)展為終末期腎衰竭[2]。因此,深入探討 AAN腎小管損傷及修復(fù)機(jī)制是很有必要的。圍繞 AA的主要及重要靶點(diǎn)—腎小管,國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究,確立了腎小管上皮細(xì)胞凋亡[3]、轉(zhuǎn)分化[4]、胞內(nèi) AA-DNA加合物形成[5]、泌尿系統(tǒng)腫瘤形成[6]等學(xué)說,這些學(xué)說能解釋 AAN腎小管毀損的部分病理特點(diǎn),然腎小管修復(fù)不良

3、的原因仍然需要進(jìn)一步闡明。近年來,腎小管管旁毛細(xì)血管(peritubular capillary,PTC)損傷及丟失或內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]在急慢性腎臟疾病,特別是慢性腎臟疾病進(jìn)展中的作用引起了廣大學(xué)者的注意[8]。因此,有必要觀察 AAN過程中,PTC損傷及丟失情況,將其與腎小管損傷及增殖修復(fù)不良的關(guān)系作一系統(tǒng)分析,并深入研究AA對PTC損傷的細(xì)胞生物學(xué)毒性機(jī)制,以期提出治療馬兜鈴酸腎病的新機(jī)制和保護(hù)治療新策略。
　　本課題擬通過建

4、立體內(nèi)動物模型觀察 PTC損傷及丟失情況,分析該損傷丟失與腎小管損傷、增殖修復(fù)的關(guān)系,并通過透射電鏡進(jìn)一步觀察 PTC內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;體外建立AA對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷模型,觀察AA毒性下內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及遷移、成管等細(xì)胞生物學(xué)變化,深入研究 AA對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制,以期為臨床治療AAN提供新的損傷機(jī)制和治療策略。
　　方法:
　　本課題擬分為體內(nèi)、體外兩部分進(jìn)行探討。
　　第一部分:體內(nèi)觀察

5、AA對 PTC的損傷作用及其與腎小管損傷、修復(fù)的相關(guān)性分析。
　　1. AAN小鼠模型建立。C57/BL/6小鼠分為4組:對照2W組,AA2W組,對照4W組,AA4W組。AA組小鼠以5mg/kg劑量每兩天腹腔注射一次AA溶液,對照組注射等體積的緩沖液(PBS)。
　　2.分別于2周、4周時(shí)收集小鼠血、尿、腎臟組織,進(jìn)行血尿生化分析及腎臟病理學(xué)觀察。
　　3.分析PTC損傷與小鼠腎小管損傷、增殖和修復(fù)的相關(guān)關(guān)系。

6、　　第二部分:體外研究AA損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。
　　1.采用文獻(xiàn)濃度分組[1],以不同濃度 AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)和不同時(shí)間(24h,48h,72h)作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC),MTT法檢測 AA對細(xì)胞增殖力的影響,篩選出藥物最適作用時(shí)間。
　　2. LDH釋放:不同濃度 AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)處理 HUVEC48h(最佳時(shí)

7、間),檢測細(xì)胞質(zhì)LDH釋放情況。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞成管:不同濃度 AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)處理HUVEC48h后,收集各組細(xì)胞,轉(zhuǎn)種于基質(zhì)膠包被的96孔板,每孔103~104個細(xì)胞,孵育6h后觀察細(xì)胞成管情況。
　　4.內(nèi)皮細(xì)胞遷移:不同濃度 AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)處理HUVEC48h后,收集各組細(xì)胞,按105/孔接種于 Transwell

8、小室,下室加入含低濃度血清(2.5％FBS)的 DMEM高糖培養(yǎng)基刺激細(xì)胞遷移,18~24h后,取出小室,固定染色后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下層細(xì)胞。
　　5.內(nèi)皮細(xì)胞凋亡:HUVEC經(jīng)不同濃度AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)作用48h后,每組收集≥105個細(xì)胞,Annexin V-FITC及 PI染色后,于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　6.線粒體膜電位變化:HUVEC經(jīng)不同濃度 AA(0μ

9、g/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)作用48h后,JC-1染色,激光共聚焦檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。
　　7.線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑:HUVEC經(jīng)不同濃度 AA(0μg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)作用48h后,收集細(xì)胞進(jìn)行 western blot實(shí)驗(yàn),觀察 Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、Apaf-1、Cytochrome C(細(xì)胞色素C)表達(dá)情況。

10、r>　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.經(jīng)腹腔注射 AA的小鼠血 Scr、BUN、尿 NAG酶較對照組明顯升高,其中AA4W較AA2W組更為明顯。
　　2. AA組小鼠腎小管損傷、間質(zhì)纖維化、PTC損傷及丟失情況較對照組明顯,其中 AA4W較 AA2W組更為明顯;與 AA4W相比,AA2W的小鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖修復(fù)情況較好。相關(guān)分析顯示 PTC丟失量與腎小管損傷積分高度相關(guān),相關(guān)關(guān)系為正相關(guān)(P<0.05);與PCN

11、A陽性表達(dá)量高度相關(guān),相關(guān)關(guān)系為負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　3. AA組小鼠PTC內(nèi)皮細(xì)胞中可見線粒體腫脹,部分線粒體脊紊亂、消失。
　　第二部分:
　　1. AA可誘導(dǎo)HUVEC活力降低、LDH釋放增加,并呈濃度依賴性。
　　2. AA可導(dǎo)致 HUVEC體外成管量減少,成管不完整,且內(nèi)皮遷移能力下降,兩者均呈濃度依賴性。
　　3. AA能誘導(dǎo)HUVEC凋亡,表現(xiàn)為凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)增高(caspase-3

12、、 BAX)、內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位下降、線粒體凋亡途徑的相關(guān)蛋白(Cytochrome C、Apaf-1、Caspase-9)表達(dá)上調(diào),而抗凋亡的蛋白 Bcl-2表達(dá)下調(diào),提示 AA可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HUVEC凋亡。
　　結(jié)論:
　　1. AA能導(dǎo)致小鼠腎PTC損傷及丟失,并隨AA作用時(shí)間延長,損傷逐漸加重,該損傷與腎小管損傷加重及增殖修復(fù)不良高度相關(guān);
　　2. AA能誘導(dǎo) HUVEC增殖抑制、成管抑制、遷移抑