海洋細菌來源的新型糖胺聚糖降解酶的篩選、鑒定與應用.pdf

1、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）又稱為粘多糖，是由重復單位組成的直鏈多糖。根據(jù)其二糖單位的不同，糖胺聚糖又被分為透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素（Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS），硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角質(zhì)素(Keratan Sulfate，KS)。糖胺聚糖

2、常常由于各種修飾酶的作用使糖鏈變得異常復雜，主要表現(xiàn)為D-葡萄糖醛酸在C5-差向異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)長-艾杜糖醛酸，糖鏈中不同部位羥基（-OH）和氨基(-NH2)的硫酸化，以及己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的復雜性賦予其功能的多樣性，不同的結(jié)構(gòu)具有不同的功能。
　　糖胺聚糖廣泛存在于動物細胞表面和細胞基質(zhì)中，常常通過與各種蛋白的相互作用參與了細胞的增殖分化、細胞間的識別、細胞轉(zhuǎn)移、組織形態(tài)發(fā)生、癌變等各種生理和病理過程。糖

3、胺聚糖所具有的一系列重要的生物學功能使其成為重要的生物活性分子，在醫(yī)藥及功能食品中得到廣泛應用，如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等。但由于糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的不均一性，特別是硫酸化糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的高度復雜性，使不同來源和不同批次的同一種糖胺聚糖在活性上存在很大差異。近年來的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通過多糖鏈中具有特殊結(jié)構(gòu)的功能區(qū)與特定蛋白的特異相互作用來實現(xiàn)的，同一多糖鏈中存在不同結(jié)構(gòu)的功能區(qū)，與不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。因此

4、通過運用底物特異性的糖胺聚糖內(nèi)切酶選擇性的部分降解糖胺聚糖多糖鏈，制備結(jié)構(gòu)均一或相對均一的特定功能區(qū)寡糖;通過運用底物特異性糖胺聚糖硫酸酯酶可以對特性功能區(qū)寡糖進行改造和修飾;通過綜合運用底物特異性糖胺聚糖內(nèi)切酶和外切酶可以對特性功能區(qū)寡糖進行測序。這些具有特異性的糖胺聚糖工具酶不僅在糖胺聚糖構(gòu)效關系研究和寡糖制備中具有重要作用，并且在神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療中也有重要作用。但是目前可以利用的糖胺聚糖工具酶屈指可數(shù)，因此尋找新型糖胺聚糖工具酶對

5、于糖胺聚糖構(gòu)效關系研究具有重要作用。
　　海洋作為生命的起源，存在大量的生命形式。海洋中存在大量的結(jié)構(gòu)多樣的糖胺聚糖，但是之前并沒有相關糖胺聚糖降解酶的研究和報道。本論文以硫酸軟骨素為唯一碳源，在海泥中篩選出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并進行了基因測序。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因，并對這些基因進行了深入研究。主要研究成果包括以下幾個方面:
　　(a)糖胺聚糖降解菌的篩選:以鯊魚軟骨來源的硫酸軟骨素CS

6、-C為唯一碳源，從海泥中篩選得到15株多糖降解菌，其中編號為FC509的菌株表現(xiàn)為對褐藻膠、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、肝素等多種多糖的降解和利用活性。因此本論文重點對FC509菌株進行研究，通過對其進行全基因組測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與糖胺聚糖降解利用相關的酶基因，并著重對其中的多個降解酶基因進行了深入研究。
　　(b)內(nèi)切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相關研究:將HCLase基因構(gòu)建到大腸桿菌表達載體中異源表達

7、，并利用鎳柱進行純化。底物降解實驗表明:該酶具有高效降解HA和CS的活性，因此被命名為HCLase?；久笇W性質(zhì)研究表明:HCLase與已報道的糖胺聚糖降解酶不同，其具有嗜鹽特性，這與它來源于海洋細菌有關，切表現(xiàn)出良好的溫度和pH穩(wěn)定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一個內(nèi)切型糖胺聚糖裂解酶，最小底物是4糖，最小產(chǎn)物是2糖。同時我們對HCLase不能降解的四糖進行了序列測定，其結(jié)構(gòu)為A4,5HexUAα1-3GalNAc(6S)β

8、1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)，這個結(jié)果揭示CS糖鏈中葡萄糖醛酸二位羥基的硫酸化會抑制HCLase對糖苷鍵的有效切割。HCLase的最大的優(yōu)點是具有超高的酶活和良好的穩(wěn)定性，這些特性使其成為具有巨大應用潛力的新型糖胺聚糖工具酶。
　　(c)外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相關研究:將HCDLase基因構(gòu)建到大腸桿菌表達載體pET30a中異源表達，并運用親和層析柱對異源表達的酶進行了純化。酶學性質(zhì)研究和底物

9、降解模式分析表明:該酶具有典型的外切型酶活性，可以從糖鏈的還原端有效降解HA、CS和DS，但不能降解Hep和HS，因此被命名為HCDLase。進一步的研究表明:HCDLase可以降解還原端熒光標記的硫酸化CS寡糖并產(chǎn)生二糖，但是不能降解熒光標記的DS和HA寡糖，這說明糖苷鍵類型和硫酸化程度影響HCDLase的降解活性。最后我們運用這種酶成功的對系列硫酸軟骨素六糖和八糖進行了測序。上述一系列研究結(jié)果表明:HCDLase作為一個新型的外切型

10、糖胺聚糖裂解酶，在糖胺聚糖的構(gòu)效關系研究，特別是復雜CS功能寡糖測序中具有重要的應用價值。
　　(d)新型內(nèi)切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相關研究:將該硫酸酯酶基因構(gòu)建到大腸桿菌表達載體pET30a中，并進行誘導表達和分離純化。基本酶學性質(zhì)研究表明:該酶在最適反應條件(30℃，pH8.0)下具表現(xiàn)出強的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:該酶與已報道的CS/DS硫酸酯酶不同，不僅可以高效去除糖鏈