海洋來源產(chǎn)蛋白酶的菌株篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究.pdf

1、中國擁有廣闊的海洋面積，海洋資源豐富多樣。海洋微生物作為海洋中一種重要的生物資源，其種類就多達(dá)100萬種以上，而目前所研究和鑒定過的海洋微生物還不到總量的5％。蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，已成為目前應(yīng)用最廣的酶類，也是目前需求量最大的酶類。傳統(tǒng)動植物來源的蛋白酶具有生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高、不易于管理控制、易受土地和季節(jié)限制等缺點，微生物日益成為工業(yè)酶制劑的主要來源，而目前國內(nèi)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶的微生物大多來源于陸地或淡水生態(tài)環(huán)境。

2、因為海洋生態(tài)環(huán)境與陸地生態(tài)環(huán)境或淡水生態(tài)環(huán)境具有很大的差異性，海洋微生物為了適應(yīng)其所處的特殊生態(tài)環(huán)境，其氨基酸組成和氨基酸序列與來源于陸地和淡水微生物蛋白源也有很大的差異，海洋微生物所產(chǎn)生的酶具有獨特的酶學(xué)性質(zhì)。因而，尋找并開發(fā)海洋來源的產(chǎn)蛋白酶微生物資源，進(jìn)一步掌握新型蛋白酶的相關(guān)特性具有重要的科研、應(yīng)用以及商業(yè)價值。
　　針對我國產(chǎn)蛋白酶微生物的來源有限，已獲得的蛋白酶產(chǎn)品種類較單一，價格相對較貴且在工業(yè)應(yīng)用中不夠深入廣泛，海

3、洋微生物資源的開發(fā)研究和綜合利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家等問題，本研究從渤海海域采集了99份海水樣品，首先通過平板透明圈法及酶活力測定法進(jìn)行篩選得到所產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株，然后通過形態(tài)觀察、生理生化特征和16SrRNA的序列分析對菌株進(jìn)行鑒定，最后分別通過響應(yīng)面法、正交試驗法對產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基的組成成分、發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了蛋白酶的活力，為以后的菌種改良及用于蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。最終得出以下主要結(jié)論:
　　1.菌株的篩

4、選。測得菌株22-1透明圈直徑/菌落直徑比（HC值）最大，為3.99;所產(chǎn)蛋白酶的酶活力最高，為30.85U/mL。
　　2.菌株的鑒定。菌株22-1的菌落在酪蛋白平板上，呈圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊，表面光滑，易挑取，易產(chǎn)生明顯的透明圈，呈短桿狀，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，與伯杰氏手冊上短小芽孢桿菌特征相一致，將16SrRNA基因序列作Blast比較，根據(jù)Gen-Bank中提供的基因序列，同源性最高的菌株為Bacillus p

5、umilus，同源性為99％，因此鑒定菌株為芽孢桿菌屬短小芽孢桿菌種。
　　3.發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的優(yōu)化。探討了碳源、氮源、金屬離子和表面活性劑對酶活力的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平響應(yīng)面法考察了主要因素玉米粉、豆餅粉和Na2HPO4對酶活力的影響，建立了酶活力與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，其中三元二次方程如下: Y=219.27+0.29*A-4.29*B+8.64*C+1.07*A*B+13.87*A*C+17.28

6、*B*C-20.50*A2-28.06*B2-23.82*C2，模型R2為99.64％，然后對方程進(jìn)行求導(dǎo)、計算極值，得到最優(yōu)營養(yǎng)成分含量為:玉米粉3.07％，豆餅粉0.99％，Na2HPO40.84％。為了驗證此模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，為了檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃?，在培養(yǎng)基優(yōu)化條件下，進(jìn)行了3次平行發(fā)酵試驗，3次試驗得到酶活力的平均值為218.87U/mL，與理論預(yù)測值相對誤差小于1％，比優(yōu)化前提高了6.14倍。
　　4.菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化。

7、在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗考察了主要因素接種量、裝液量、溫度和發(fā)酵時間對酶活力的影響，依據(jù)單因素的試驗結(jié)果，并利用極差分析及SPSS軟件對正交實驗結(jié)果進(jìn)行方差顯著性分析得出:發(fā)酵時間對酶活力的影響極顯著(p＜0.01)，培養(yǎng)溫度對酶活力的影響顯著(p＜0.05)四因素作用強(qiáng)弱順序為:D（發(fā)酵時間）＞C（培養(yǎng)溫度）＞B（接種量）＞A（裝液量），確定最優(yōu)組合為:A2B2C2D2，即發(fā)酵時間72h，培養(yǎng)溫度37℃，接種量3