海洋來(lái)源產(chǎn)蛋白酶的菌株篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究.pdf

1、中國(guó)擁有廣闊的海洋面積，海洋資源豐富多樣。海洋微生物作為海洋中一種重要的生物資源，其種類就多達(dá)100萬(wàn)種以上，而目前所研究和鑒定過(guò)的海洋微生物還不到總量的5％。蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，已成為目前應(yīng)用最廣的酶類，也是目前需求量最大的酶類。傳統(tǒng)動(dòng)植物來(lái)源的蛋白酶具有生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、不易于管理控制、易受土地和季節(jié)限制等缺點(diǎn)，微生物日益成為工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源，而目前國(guó)內(nèi)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶的微生物大多來(lái)源于陸地或淡水生態(tài)環(huán)境。

2、因?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)環(huán)境與陸地生態(tài)環(huán)境或淡水生態(tài)環(huán)境具有很大的差異性，海洋微生物為了適應(yīng)其所處的特殊生態(tài)環(huán)境，其氨基酸組成和氨基酸序列與來(lái)源于陸地和淡水微生物蛋白源也有很大的差異，海洋微生物所產(chǎn)生的酶具有獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì)。因而，尋找并開發(fā)海洋來(lái)源的產(chǎn)蛋白酶微生物資源，進(jìn)一步掌握新型蛋白酶的相關(guān)特性具有重要的科研、應(yīng)用以及商業(yè)價(jià)值。
　　針對(duì)我國(guó)產(chǎn)蛋白酶微生物的來(lái)源有限，已獲得的蛋白酶產(chǎn)品種類較單一，價(jià)格相對(duì)較貴且在工業(yè)應(yīng)用中不夠深入廣泛，海

3、洋微生物資源的開發(fā)研究和綜合利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家等問(wèn)題，本研究從渤海海域采集了99份海水樣品，首先通過(guò)平板透明圈法及酶活力測(cè)定法進(jìn)行篩選得到所產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株，然后通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征和16SrRNA的序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，最后分別通過(guò)響應(yīng)面法、正交試驗(yàn)法對(duì)產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基的組成成分、發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了蛋白酶的活力，為以后的菌種改良及用于蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。最終得出以下主要結(jié)論:
　　1.菌株的篩

4、選。測(cè)得菌株22-1透明圈直徑/菌落直徑比（HC值）最大，為3.99;所產(chǎn)蛋白酶的酶活力最高，為30.85U/mL。
　　2.菌株的鑒定。菌株22-1的菌落在酪蛋白平板上，呈圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊，表面光滑，易挑取，易產(chǎn)生明顯的透明圈，呈短桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，與伯杰氏手冊(cè)上短小芽孢桿菌特征相一致，將16SrRNA基因序列作Blast比較，根據(jù)Gen-Bank中提供的基因序列，同源性最高的菌株為Bacillus p

5、umilus，同源性為99％，因此鑒定菌株為芽孢桿菌屬短小芽孢桿菌種。
　　3.發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的優(yōu)化。探討了碳源、氮源、金屬離子和表面活性劑對(duì)酶活力的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平響應(yīng)面法考察了主要因素玉米粉、豆餅粉和Na2HPO4對(duì)酶活力的影響，建立了酶活力與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，其中三元二次方程如下: Y=219.27+0.29*A-4.29*B+8.64*C+1.07*A*B+13.87*A*C+17.28

6、*B*C-20.50*A2-28.06*B2-23.82*C2，模型R2為99.64％，然后對(duì)方程進(jìn)行求導(dǎo)、計(jì)算極值，得到最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)成分含量為:玉米粉3.07％，豆餅粉0.99％，Na2HPO40.84％。為了驗(yàn)證此模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕谂囵B(yǎng)基優(yōu)化條件下，進(jìn)行了3次平行發(fā)酵試驗(yàn)，3次試驗(yàn)得到酶活力的平均值為218.87U/mL，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于1％，比優(yōu)化前提高了6.14倍。
　　4.菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化。

7、在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)考察了主要因素接種量、裝液量、溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力的影響，依據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，并利用極差分析及SPSS軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差顯著性分析得出:發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力的影響極顯著(p＜0.01)，培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響顯著(p＜0.05)四因素作用強(qiáng)弱順序?yàn)?D（發(fā)酵時(shí)間）＞C（培養(yǎng)溫度）＞B（接種量）＞A（裝液量），確定最優(yōu)組合為:A2B2C2D2，即發(fā)酵時(shí)間72h，培養(yǎng)溫度37℃，接種量3