基于芳香烴受體系統(tǒng)的痕量二惡英生物檢測(cè)方法的研究.pdf

1、目的：采用分子生物和生物化學(xué)技術(shù),依據(jù)芳香烴受體(AhR)在二惡英的活化作用下能與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(ARNT)特異性結(jié)合的分子機(jī)制。本課題旨在探索一種基于芳香烴受體系統(tǒng)的快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且特異性很強(qiáng)的二惡英生物檢測(cè)方法。
　　 方法：(1)以小鼠肝組織中提取的總RNA為模板,采用RT-PCR的方法擴(kuò)增目的基因,DNA測(cè)序分析驗(yàn)證后,利用pGEX-5X-1表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建AhR和ARNT全長(zhǎng)及相應(yīng)片段AhR-PAS、AhR-C和

2、ARNT-PAS共5個(gè)蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒。酶切鑒定后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中,在該原核系統(tǒng)中大量表達(dá)目的蛋白質(zhì),采用谷光甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione SepharoseTM4B)親和層析純化GST-融合蛋白或利用凝血因子X(jué)a對(duì)融合蛋白的進(jìn)行酶切獲得目的蛋白質(zhì)。(2)利用AhR-PAS和AhR-C這兩個(gè)特異性片段蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。(3)從C57BL/6J純系小鼠肝組織中提取具有結(jié)

3、合活性的天然AhR,采用Bradford法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量,計(jì)算出其中AhR的含量。(4)將天然AhR與GST-ARNT、GST-ARNT-PAS以等摩爾的比例混合,在室溫下與不同劑量的TCDD進(jìn)行溫育結(jié)合。將結(jié)合了的GST-ARNT-AhR復(fù)合物用Glutathione Scpha-roseTM4B珠子進(jìn)行親和吸附,并用結(jié)合緩沖液洗去非特異性結(jié)合蛋白。最后采用免疫印跡(Western Blot)等方法,以AhR-PAS或AhR-C兩種

4、蛋白制得的多克隆抗體作為檢測(cè)所需的一抗,研究AhR與融合蛋白ARNT、ARNT-PAS結(jié)合的條件、程度及劑量反應(yīng)關(guān)系,從而對(duì)TCDD進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：(1)成功地克隆了目的基因并在原核系統(tǒng)中表達(dá)了相應(yīng)蛋白；(2)免疫家兔獲得2種高效價(jià)的多克隆抗體,免疫印跡的檢測(cè)下限分別是1ng和5ng；(3)從C57BL/6J純系小鼠肝組織中提取出具有結(jié)合活性的天然AhR,其濃度為3-7.2pmol/mlcytosol；(4)克隆蛋白