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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景和目的:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT3)是一個(gè)可以被不同的細(xì)胞因子受體激活的轉(zhuǎn)錄因子,與細(xì)胞的增殖、生存、血管生成以及遷移等密切關(guān)聯(lián)。STAT3在多種腫瘤細(xì)胞(包括白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液腫瘤以及肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤)中表達(dá)異常升高,與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而抑制STAT3活性,則癌細(xì)胞
2、出現(xiàn)凋亡。最近的研究發(fā)現(xiàn),抑制STAT3信號(hào)通路可以克服包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、白血病等多種腫瘤的化學(xué)耐藥性。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以抑制STAT3激活的小分子化合物Kifocitanib-齊福斯尼。因此,本課題旨在明確Kifocitanib對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的作用,并揭示其作用機(jī)理。
研究方法:
?。?)利用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法,檢測(cè)Kifocitanib對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的存活率及增殖的影響;
?。?)流
3、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Kifocitanib對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響;
(3)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;檢測(cè)與STAT3信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;
?。?)用免疫熒光染色方法檢測(cè)p-STAT3蛋白的表達(dá)及定位;
?。?)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Kifocitanib對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移的影響;
?。?)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):構(gòu)建骨髓瘤的裸鼠異種移
4、植腫瘤模型,檢測(cè)Kifocitanib對(duì)裸鼠腫瘤體積大小及裸鼠體重的影響,同時(shí)觀察Kifocitanib對(duì)裸鼠有無(wú)毒性作用。
研究結(jié)果:
?。?)Kifocitanib對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。分別選用了六種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞存活和增殖狀況的分析表明,KIF對(duì)這些細(xì)胞的增殖均呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。
?。?)Kifocitanib誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙
5、染,流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞所占的比例依濃度升高而顯著升高。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明,促進(jìn)了caspase-3和caspase-9的裂解激活,并活化了PARP。另外,它對(duì)凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)也有抑制作用。
(3) Kifocitanib影響了細(xì)胞周期的進(jìn)程。應(yīng)用Western blotting檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白,包括多種Cyclins、CDK4、6、E2F-1和 p-RB。結(jié)果顯示Kifo
6、citanib均下調(diào)了這些蛋白的表達(dá),并呈濃度依賴性;進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在G0/G1期所占比例隨藥物濃度的增加而增多。
?。?)Kifocitanib抑制了STAT3的活化。Western blot檢測(cè)表明,Kifocitanib對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞STAT3內(nèi)源性活化和白介素-6(IL-6)刺激引起的STAT3的外源性活化均有抑制作用。免疫熒光染色檢測(cè)RPMI-8226細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá),同樣證實(shí)Kifo
7、citanib對(duì)其活化有抑制作用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(HS-5)和骨髓瘤細(xì)胞(OPM2 and U266)共培養(yǎng)條件下,Kifocitanib也對(duì)STAT3的活化有抑制作用。
?。?)Kifocitanib阻礙了STAT3的核輸出。分離RPMI-8226細(xì)胞的胞核、胞漿,分別檢測(cè)給藥后STAT3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不論是在全培養(yǎng)條件下還是饑餓時(shí),給藥后STAT3在胞核中水平升高,提示Kifocitanib阻礙了STAT3的核輸出。
8、> ?。?)Kifocitanib抑制了STAT3信號(hào)通路的進(jìn)行。通過(guò)對(duì)STAT3上、下游信號(hào)的激活情況的檢測(cè)表明,Kifocitanib抑制了STAT3上游JAK2、c-Src的磷酸化水平,并下調(diào)了下游靶蛋白(Mcl-1、Bcl-2、CCND2、VEGF等)的表達(dá)。
(7)Kifocitanib抑制了細(xì)胞的遷移。選用人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對(duì)象,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)證實(shí),Kifocitanib能明顯抑制細(xì)胞的遷
9、移。
?。?)Kifocitanib抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。我們構(gòu)建了一個(gè)裸鼠體內(nèi)骨髓瘤的異種移植模型,通過(guò)14天連續(xù)給藥對(duì)其腫瘤體積大小和體重的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn), Kifocitanib能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng),而對(duì)其體重?zé)o明顯影響。Kifocitanib也抑制了腫瘤組織中STAT3的表達(dá)及其活化。
結(jié)論:我們?cè)趪?guó)內(nèi)外最先發(fā)現(xiàn) Kifocitanib具有抗多發(fā)性骨髓瘤的活性,其通過(guò)抑制 STAT3的活化來(lái)引起下游靶基因蛋白表達(dá)抑制
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