Uncv無毛小鼠iRhom2突變體分子功能的初步研究.pdf

1、目前研究發(fā)現(xiàn)，90多個基因影響小鼠皮膚及毛發(fā)，其中有數(shù)十種能夠引起小鼠皮膚和被毛結(jié)構(gòu)的突變。除眾所周知的常用于免疫學(xué)科、腫瘤學(xué)科等研究的裸鼠外，在美國、日本等發(fā)達(dá)國家還培育繁殖了多達(dá)二十多個突變的無毛小鼠的品種，其可為護(hù)膚品的研制、皮膚病的研究提供豐富的實驗材料，而我國至今培育的該類小鼠較少，應(yīng)用不廣泛。
　　本研究中所用到的動物模型，是由本研究單位自己培育成群的一種自發(fā)突變的Uucv無毛突變小鼠。它的遺傳表現(xiàn)：純合突變?yōu)闊o毛表型

2、，雜合突變是稀毛表型。在之前的遺傳學(xué)相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)該小鼠被毛的異常是由單基因的常染色體半顯性遺傳引起。其后代的表型嚴(yán)格遵循孟德爾遺傳規(guī)律。裸鼠經(jīng)過皮膚能夠觀察到一些內(nèi)臟器官的形態(tài)，但該突變小鼠與裸鼠有差異，該鼠免疫功能正常，皮膚較裸鼠厚。在生物醫(yī)學(xué)方面，由于該突變純合子小鼠無毛、操作簡便易行，能在普通環(huán)境下存活、繁殖?；谶@些特點，該鼠可用于皮膚學(xué)、化妝品等領(lǐng)域的研究。在前期課題組成員的研究中，通過基因連鎖分析最終確定，突變基因位于小

3、鼠11號染色體的D11mit338和 D11mit337之間，并通過基因組掃描方式定位了該突變基因為iRhom2（iRhom2mut）。
　　果蠅的iRhom2通過與ER配體家族的相互作用，可以調(diào)節(jié)EGF信號通路，分流到ER相關(guān)的降解（ERAD）途徑。iRhoms家族在所有多細(xì)胞動物中都是保守的，且在細(xì)胞培養(yǎng)中的鑒定也極為相似，iRhom1和iRhom2都能促進(jìn)EGF的降解。與 iRhom1不同的是，iRhom2在免疫細(xì)胞大量表達(dá)

4、，尤其是巨噬細(xì)胞，且它的表達(dá)上調(diào)刺激LPS應(yīng)答。TACE為TNF的轉(zhuǎn)化酶，與野生型iRhom2細(xì)胞相比，突變型的iRhom2的巨噬細(xì)胞無TACE，這意味著細(xì)胞內(nèi)外運輸存在根本的缺陷。
　　iRhom2mut基因的N端有309bp的缺失，缺失區(qū)域包括外顯子和內(nèi)含子，其中缺失的內(nèi)含子完整。而外顯子缺失231bp，剛好是一個完整的閱讀框，從而導(dǎo)致了無毛性狀的產(chǎn)生。雖然iRhom2蛋白在進(jìn)化過程中已經(jīng)失去了蛋白酶活性，但它們?nèi)匀槐３种匾?/p>

5、的非蛋白酶活性，主要是與蛋白水解釋放有關(guān)。iRhom2必須要與TACE結(jié)合，才能將其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體。TACE的前體必須要在高爾基體內(nèi)經(jīng)過furin的剪切才能成熟，從而影響其下游蛋白的分泌，如熟知的TNF-α、EGF。因此，iRhom2可以通過控制TACE的表達(dá)量影響其下游蛋白的分泌。且iRhom2可以經(jīng)過TACE調(diào)節(jié)Notch1和Wnt信號通路，從而影響毛囊的分化。iRhom2的另一個功能是能夠通過 ERAD作用于 EGF前體從

6、而降解EGF。課題組前期的工作也證實iRhom2能夠影響TACE基因的成熟，但新的文獻(xiàn)報道iRhom2的基因敲除小鼠，反而具有被毛。這些結(jié)果推測，iRhom2基因的N端309bp的缺失，可能使突變蛋白具有了新的功能。因此課題組擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)野生型iRhom2以及iRhom2mut的細(xì)胞系，為對iRhom2mut進(jìn)行新的功能的相關(guān)研究打下基礎(chǔ)，以期為研究毛囊的特性提供較好的實驗動物模型。
　　本研究初步探討了野生型iRhom2和iR

7、hom2mut在Vero細(xì)胞中的表達(dá)情況、目的蛋白的定位、以及對Vero細(xì)胞生長情況的影響，包括以下方面：
　?。?）野生型iRhom2及iRhom2mut基因的獲得
　　采用分子克隆技術(shù)，剪取Uncv無毛小鼠的鼠尾并提取基因組，設(shè)計引物鑒定突變基因為陽性。其后提取陽性小鼠皮膚RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，根據(jù)NCBI公布的iRhom2序列設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增獲得野生型iRhom2及iRhom2mut的基因編碼區(qū)，經(jīng)瓊脂糖

8、凝膠電泳鑒定后，膠回收PCR產(chǎn)物，連接T載體搖菌后涂板，對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，正確后4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?br>　?。?）野生型iRhom2及其突變基因iRhom2mut穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立
　　應(yīng)用基因重組技術(shù)，將獲得的野生型 iRhom2和 iRhom2mut基因片段克隆到慢病毒載體 Lenti-OE-Flag，構(gòu)建重組慢病毒載體 Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2 mut，并通過PCR、雙酶切、測序等

9、方法進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。
　　同時，通過利用293T包裝細(xì)胞，對重組質(zhì)粒 Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2 mut進(jìn)行病毒包裝，收集的病毒顆粒感染目的細(xì)胞，進(jìn)行滴度測定，進(jìn)而通過puromycin抗生素進(jìn)行篩選，建立野生型iRhom2及iRhom2mut的Vero細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。經(jīng)過Western Blot驗證，蛋白為95KD，與預(yù)期蛋白質(zhì)分子量吻合，成功獲得穩(wěn)定細(xì)胞系

10、。
　?。?）PKH26和Hoechst33258聯(lián)合示蹤目的蛋白
　　目的蛋白和綠色熒光蛋白融合表達(dá)后，可以在熒光顯微鏡下直接觀察到目的蛋白的位置。PKH26和Hoechst33258兩種熒光染料均可良好地標(biāo)記細(xì)胞，但將PKH26膜染料和Hoechst33258核染料兩者聯(lián)合起來進(jìn)行標(biāo)記的文獻(xiàn)鮮有。本研究采用PKH26和Hoechst33258聯(lián)合標(biāo)記野生型iRhom2及iRhom2mut的穩(wěn)定細(xì)胞系，顯示雙標(biāo)方法成功。通

11、過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察目的蛋白，發(fā)現(xiàn)野生型iRhom2分布在細(xì)胞的胞漿，而iRhom2mut于細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)都存在，推測iRhom2的N末端缺失突變可能對其細(xì)胞內(nèi)的定位有影響。
　?。?）野生型iRhom2及iRhom2mut對細(xì)胞生長特性的影響
　　本課題分別通過WST-1法和Annexin-V/PI法檢測細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的情況，并與正常的導(dǎo)入空載體的Vero細(xì)胞相比較。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的野生型iR

12、hom2和iRhom2mut均可以抑制Vero細(xì)胞的凋亡。同時，對WST-1檢測的結(jié)果做出生長曲線，發(fā)現(xiàn)野生型iRhom2和iRhom2mut可以提高細(xì)胞活力。提示野生型iRhom2和iRhom2mut可能促進(jìn)細(xì)胞生長因子的表達(dá)和分泌，進(jìn)而使凋亡率降低。
　　結(jié)論：
　　野生型iRhom2和iRhom2mut可以增強(qiáng)細(xì)胞活力；野生型iRhom2分布在細(xì)胞的胞漿，而iRhom2mut細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)都存在；iRhom2的N末