IRHOM2通過調控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機制研究.pdf

1、肺纖維化是以彌漫性間質纖維化為特征的一類疾病，其中50％以上原因不明，稱之為特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）。肺纖維化預后較差，治療不敏感，肺移植是目前終末期肺纖維化患者唯一有效的治療方法。肺纖維化致病機制不明，可能和肺損傷后炎癥反應以及異常修復有關。
　　肺纖維化是肺損傷的重要階段，肺損傷后的修復大致可分為三個階段:炎癥反應期，肉芽組織生成和細胞外基質沉積期，基質重構和肉芽組織

2、分界期。損傷發(fā)生后，宿居的成纖維細胞活化，纖維細胞也被募集到損傷部位，并分化為平滑肌動蛋白α(α-SMA)陽性的肌成纖維細胞，使細胞外基質蛋白沉積，以促進損傷修復和組織的完整性。有研究發(fā)現Ⅱ型肺泡上皮細胞反復的損傷修復，標志性的出現在IPF患者和肺纖維化動物模型中，纖維化標記物α-SMA、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)等表達上調，同時上皮細胞骨架重建變?yōu)榧忓N形，最終轉化為間葉細胞。肺臟損傷修復的結果是纖維化還是恢復正常解剖結構，取決于

3、肺泡內滲出物及細胞外基質蛋白沉積能否有效清除，過多的細胞外基質蛋白沉積可導致組織纖維化。
　　促炎性因子TNF-α在肺纖維中起關鍵作用。早先研究發(fā)現，TNF-α參與肺損傷后修復，在肺損傷后組織中高表達，且與肺損傷程度相關。TNF-α可直接或間接通過受體，刺激胞外基質沉積，并上調纖維化標志物Ⅰ型膠原和α-SMA的表達。進一步研究發(fā)現，TNF-α通過跨膜受體激酶，調控核內靶基因的轉錄，在肺纖維化中引起肌成纖維細胞的增殖分化，是肺纖維化

4、的重要致病途徑。
　　非活性的菱形蛋白2（inactive rhomboid-like protein2，IRHOM2）屬于rhomboid蛋白家族，目前發(fā)現的rhomboid蛋白家族成員豐富，有十余種，參與細胞內外的信號轉導，如rhomboid家族中的RHBDD3可抑制NK細胞TLR3通路的活化。Freeman等人研究發(fā)現IRHOM2是抗病原體防御和睡眠的調控蛋白。在微生物入侵時，巨噬細胞等會分泌TNF-α，并且將其轉移到胞膜處

5、，而后胞膜處的腫瘤壞死因子轉化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE)會促進TNF-α的釋放。IRHOM2可以和內質網中的TACE蛋白結合，促進TACE離開內質網到達胞膜發(fā)揮功能。所以，抑制IRHOM2蛋白表達，可導致TACE無法成熟，不能發(fā)揮以上功能。另外，有研究表明Rhbdf2（編碼IRHOM2）敲除小鼠關節(jié)炎癥明顯減輕，關節(jié)腫脹減輕、臨床評分降低，滑液驗證關節(jié)侵蝕減輕，說明

6、IRHOM2在關節(jié)炎癥中的作用。
　　因此，IRHOM2可能通過TNF-α信號通路調控小鼠肺纖維化。通過研究觀察博來霉素誘導的野生小鼠肺組織及肺細胞中IRHOM2變化，以及調控肺泡上皮細胞中IRHOM2來觀察上皮間質化的程度，有利于闡明IRHOM2在肺纖維化中的作用機制，為臨床尋找干預肺纖維化提供新的線索和靶點，為防治肺纖維化提供理論依據和臨床策略。
　　第一部分小鼠肺纖維化對肺組織及細胞IRHOM2及TNF-α的影響

7、>　　小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-α的影響
　　目的:建立小鼠肺纖維化模型，研究小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-α的影響
　　方法:C57BL/6小鼠隨機分為2組(n=6)，對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg)，對照組經氣管給予生理鹽水(2ml/kg)，第14天后取肺組織，通過心尖動脈血氣分析，肺葉組織HE及Masson病理學染色檢查，肺葉組織

8、羥脯氨酸含量檢測，肺葉組織濕干重比，測定評估肺功能改變及小鼠肺纖維化程度，并收集小鼠肺泡灌洗液(BALF) ELISA測定TNF-α水平，免疫組化法染色測定Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)、平滑肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)在肺組織中含量，Western Blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ以及IRHOM2蛋白，進一步評價IRHOM2及其他相關蛋白在小鼠肺纖維化中的表達情況。
　　結果:與對照組相比，肺纖

9、維化組給藥后第14天成功誘發(fā)小鼠肺纖維化，心尖部動脈血氧分壓降低，肺泡結構大面積實變，肺泡腔縮小，遍布成纖維細胞，Masson染色可見大量藍色膠原纖維，肺葉羥脯氨酸含量及濕干重比增加，肺泡灌洗液中TNF-α增加;免疫組化顯示collagen-Ⅰ、α-SMA和FN在肺組織中含量增加;Western Blot顯示小鼠肺纖維后肺組織IRHOM2蛋白含量降低、collagen-Ⅰ和α-SMA增加。
　　結論:鹽酸博來霉素致小鼠肺纖維化可以

10、上調小鼠肺組織和肺泡灌洗液中TNF-α的含量，但IRHOM2蛋白水平降低。
　　小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞中IRHOM2及TNF-α的影響
　　目的:小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細胞(AT-Ⅱ)和肺泡巨噬細胞（AM）中IRHOM2、TNF-α的影響
　　方法:C57BL/6小鼠隨機分為2組(n=6)，對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg)，對照組經氣管

11、給予生理鹽水(2ml/kg)，于第14天在戊巴比妥麻醉下，分離提取原代肺泡巨噬細胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細胞，純化后細胞孵箱培養(yǎng)。1、肺泡巨噬細胞純化后ELISA檢測細胞和培養(yǎng)液中TNF-α的含量。2、原代Ⅱ型上皮細胞純化培養(yǎng)24 h后，檢測細胞和培養(yǎng)液中TNF-α的含量。3、Western Blot方法檢測原代肺泡巨噬細胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白的含量變化。
　　結果:與對照組相比，1、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細胞及其

12、細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量增加。2、Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α的水平降低。3、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細胞中IRHOM2蛋白水平增加，Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白水平降低。
　　結論:小鼠肺纖維化可以上調肺泡巨噬細胞及培養(yǎng)液中TNF-α的含量，并使IRHOM2蛋白水平增加;同時下調Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量，并使IRHOM2蛋白水平減少。
　　第二部分引起Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2變化的主要因

13、素及IRHOM2在上皮間質轉化(EMT)中的作用
　　目的:研究肺纖維化中，主要引起小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2變化的原因，并研究IRHOM2蛋白在肺纖維化主要細胞機制——上皮間質轉化中的作用。
　　方法:C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=6)，對照組(AT-Con)提取純化原代Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞，并用巨噬細胞純化后培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞;纖維化因子組(AT-Fb)用肺纖維化小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清液

14、培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞;博來霉素組(AT-BLM)則在巨噬細胞培養(yǎng)上清中加入博來霉素培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞;TNF-α組(AT-TNF)則在巨噬細胞培養(yǎng)上清中加入TNF-α培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞。Western Blot方法檢測4組Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2含量的變化。
　　培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮A549細胞系平均接種六孔板中分為3組(n=3)，對照組(A-Con)為1640培養(yǎng)液;上皮間質化組(A-EMT)在其1640培養(yǎng)液中加入鹽酸

15、博來霉素，IRHOM2蛋白敲減組(A-RNAi)則為慢病毒轉染A549細胞，轉染后細胞中IRHOM2蛋白明顯下調，并在其1640培養(yǎng)液中加博來霉素培養(yǎng)。24 h后提取細胞蛋白，Western Blot方法檢測三組間代表上皮間質化水平的collagen-Ⅰ和α-SMA含量。
　　結果:培養(yǎng)24 h后Western Blot結果顯示，與對照組相比，博來霉素組Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白含量變化不明顯，而纖維化因子組及TNF-α組

16、中Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白明顯降低。Western Blot檢測結果顯示，與對照組相比，上皮間質化組細胞中collagen-Ⅰ和α-SMA含量增加，IRHOM2蛋白敲減組間質化程度介于對照組與上皮間質化組之間。
　　結論:提示參與改變肺泡上皮細胞中IRHOM2表達量的直接因素可能是肺纖維化小鼠巨噬細胞培養(yǎng)液中的炎性因子，而非博來霉素，并且在上皮間質化細胞模型中，IRHOM2敲減可以下調Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT指標，提示可緩