不同年齡和性別影響對乙酰氨基酚急性肝損傷敏感性差異的機制研究.pdf

1、背景/目的：
　　對乙酰氨基酚（APAP）是臨床上兒童常見的解熱鎮(zhèn)痛藥物，其過量或不當使用引起的急性肝臟損傷是兒童藥物性肝損傷的常見原因之一。然而，目前關于兒童和成人之間APAP急性肝損傷是否存在差異報道甚少。既往研究表明APAP在肝細胞內經P450代謝酶CYP2E1代謝生成有毒產物N-乙酰對苯醌亞胺（NAPQI），耗竭胞內還原型谷胱甘肽（GSH）進而引起氧化應激、線粒體功能障礙并最終導致肝細胞死亡。近期研究提示，APAP急性肝損

2、傷過程發(fā)生二次打擊，TLR4信號可能介導APAP急性肝損傷“二次打擊”過程中肝細胞程序性壞死。
　　本課題比較不同年齡和性別小鼠對APAP急性肝損傷的敏感性差異，為今后更好地指導不同人群APAP肝損傷的臨床治療提供理論依據；比較野生型（C3H/HeN）與TLR4突變型（C3H/HeJ）小鼠APAP肝損傷的差異，初步探討TLR4在APAP急性肝損傷不同階段的作用。
　　方法：
　　研究一、不同年齡和性別小鼠對APAP急性

3、肝損傷的敏感性差異由兩個實驗組成：實驗一、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）和成年（8周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）分成四組：幼年雄性小鼠、幼年雌性小鼠、成年雄性小鼠和成年雌性小鼠，每組各10只小鼠。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時后經腹腔注射給予單劑量APAP（300mg/kg），觀察各組小鼠生存情況至APAP給藥后的第7天。繪制各組生存曲線并比較各組小鼠生存率差異。實驗二、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各40只）和成年（8周）

4、CD-1小鼠（雌、雄各40只）各分成APAP給藥組和對照組。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時。所有APAP給藥組小鼠經腹腔注射給予APAP（300mg/kg），對照組給予生理鹽水。給藥后不同時點（第0，1，4和24小時及第7天）剖殺小鼠，比較各組肝指數，檢測血清ALT和肝臟GSH、GSSG與GSSG/GSH水平，用HE染色以觀察組織肝臟病理學損傷，用TUNEL檢測肝細胞死亡，用免疫組化檢測肝臟硝化酪氨酸（3-NT）；用實時定量RT-PCR檢測肝

5、臟Cyp1a1、Cyp2e1、Cyp3a11、Ugt1a1、Gpx、Gr和Gst基因表達水平；用試劑盒檢測肝臟GPX、GR和GST活性；用Western blot檢測肝臟CYP2E1、p-JNK、JNK、RIP1和RIP3蛋白水平。
　　研究二、TLR4在APAP急性肝損傷發(fā)生過程中的作用由兩個實驗組成：實驗一、野生型（C3H/HeN）小鼠和突變型（C3H/HeJ）小鼠各10只，統(tǒng)一禁食12小時后給予APAP（300mg/kg）單

6、劑量腹腔注射，觀察各組小鼠生存情況至APAP給藥后72 h。繪制兩組小鼠生存曲線并比較兩組小鼠生存率的差異。實驗二、野生型（C3H/HeN）小鼠和突變型（C3H/HeJ）小鼠各分成APAP給藥組和對照組。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時。APAP給藥組小鼠經腹腔注射給予APAP（300mg/kg），對照組給予等體積生理鹽水。給藥后不同時點（第0，4和12 h）剖殺小鼠，比較兩組小鼠肝指數，檢測血清 ALT水平，用 HE染色以觀察肝臟病理學損傷，

7、用TUNEL檢測肝細胞死亡，用Western blot檢測肝臟p-JNK、JNK以及程序性壞死相關蛋白激酶RIP1、RIP3蛋白的表達。
　　結果：
　　幼年小鼠APAP急性肝損傷較同性別成年小鼠更嚴重。小鼠生存實驗結果提示，雄性或雌性幼年小鼠生存率（雄性50%、雌性60%）均顯著低于成年小鼠（雄性80%、雌性90%）。進一步觀察發(fā)現，與同性別成年小鼠相比，給藥后4小時幼年小鼠肝指數和血清ALT水平上升更明顯，組織病理學觀察

8、到肝臟充血明顯；至給藥后24小時雄性和雌性幼年小鼠血清ALT水平仍明顯高于同性別成年小鼠，組織病理學觀察到肝臟呈小葉中心性壞死，且幼年小鼠肝臟壞死面積明顯大于同性別成年小鼠；TUNEL檢測顯示，幼年小鼠肝臟TUNEL陽性細胞數明顯高于同性別成年小鼠；免疫印跡實驗結果顯示，APAP處理后幼年小鼠肝臟p-JNK和RIP3的蛋白水平均明顯高于同性別成年小鼠。免疫組化顯示，APAP處理后4小時和24小時幼年小鼠肝臟硝化酪氨酸（3-NT）陽性細胞

9、數明顯多于同性別成年小鼠。為探討幼年小鼠對APAP肝損傷更敏感的機制，比較了不同年齡和性別小鼠肝臟APAP代謝酶水平和GSH代謝情況。結果顯示，與同性別成年小鼠相比，幼年小鼠在APAP給藥后肝臟GSH耗竭量更大，GSSG/GSH比值上升更明顯；進一步分析發(fā)現，幼年小鼠肝臟Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均較同性別成年小鼠更高。本課題發(fā)現，APAP急性肝損傷性別差異只存在于成年小鼠，成年雄性小鼠APAP急

10、性肝損傷較成年雌性小鼠更嚴重。APAP處理后4小時和24小時成年雄性小鼠血清ALT水平均高于成年雌性小鼠；組織病理學觀察到成年雄性小鼠肝臟壞死面積明顯大于成年雌性小鼠；TUNEL檢測提示，成年雄性小鼠肝臟 TUNEL陽性細胞數明顯高于成年雌性小鼠。進一步觀察發(fā)現，APAP處理后4小時成年雄性小鼠肝臟p-JNK水平明顯高于成年雌性小鼠；免疫組化顯示，APAP處理后4小時和24小時成年雄性小鼠肝臟3-NT陽性細胞數明顯多于成年雌性小鼠。AP

11、AP處理后4小時成年雄性小鼠肝臟GSH消耗量較成年雌性小鼠大，且GSSG/GSH比值恢復速度明顯慢于成年雌性小鼠；成年雄性小鼠肝臟GPX和GST活性均低于成年雌性小鼠。
　　野生型（C3H/HeN）小鼠APAP急性肝損傷較突變型（C3H/HeJ）小鼠更嚴重。72h生存曲線結果提示野生型（C3H/HeN）小鼠給藥4小時后即發(fā)生死亡，72小時生存率為40%；（C3H/HeJ）小鼠至給藥8小時才發(fā)生死亡，72小時生存率為70%。故野生型

12、（C3H/HeN）小鼠較突變型（C3H/HeJ）小鼠生存率低。APAP處理4 h后，C3H/HeN小鼠肝指數較C3H/HeJ小鼠上升明顯。給藥4 h和12 h，C3H/HeN小鼠血清ALT水平均較C3H/HeJ小鼠高。肝臟HE染色提示，C3H/HeN小鼠肝臟壞死面積較大。肝臟TUNEL結果提示，C3H/HeN小鼠肝臟TUNEL+陽性細胞數明顯多于C3H/HeJ小鼠。C3H/HeN小鼠在給藥后的4 h和12 h，肝臟p-JNK的表達均高于

13、C3H/HeJ小鼠。給藥后4 h，C3H/HeN小鼠肝臟RIP1的表達高于C3H/HeJ小鼠；給藥后12 h，C3H/HeN小鼠肝臟RIP1的表達與C3H/HeJ小鼠無差異，但肝臟RIP3的表達明顯高于C3H/HeJ小鼠。
　　結論：
　　不同年齡小鼠對 APAP急性肝損傷存在敏感性差異，幼年小鼠更易于發(fā)生APAP急性肝臟損傷。其機制可能與幼年小鼠肝臟 Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均較同

14、性別成年小鼠更高；幼年小鼠對于APAP引起的肝臟GSH耗竭更敏感；APAP處理后幼年小鼠肝臟P-JNK和RIP3蛋白表達更高有關。APAP急性肝損傷的性別差異只存在于成年小鼠，具體表現為成年雄性小鼠比成年雌性小鼠肝臟損傷更明顯。其機制可能與成年雄性小鼠肝臟GSH代謝酶（GPX和 GST）活性比成年雌性小鼠低，APAP處理后成年雄性小鼠肝臟 GSH消耗多，進而抗氧化以及促進有毒代謝產物的排出能力降低，加劇肝細胞JNK持續(xù)性激活，繼而導致肝