樹突狀細(xì)胞在小鼠哮喘發(fā)病中的分子機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘(asthma)是一種全球性的嚴(yán)重威脅公眾健康的常見疾病，并且發(fā)病率仍呈上升趨勢，但對其發(fā)病機(jī)理還不完全明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘是一種以T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞在氣道浸潤為特征的慢性氣道炎癥，其免疫異常表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞的過度活化，Th1/Th2細(xì)胞比例和功能的失衡。而樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)是機(jī)體內(nèi)抗原遞呈功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcells

2、,APCs)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在體外激活初始T(naiveT)細(xì)胞的APC，其在誘導(dǎo)Th1/Th2型細(xì)胞反應(yīng)平衡和偏移過程中起關(guān)鍵作用。為了從分子水平探討DC在小鼠哮喘模型中的作用，本研究用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏小鼠，建立哮喘模型。然后用重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinantmousegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,rmGM-CSF

3、)和重組白細(xì)胞介素4(recombinantmouseinterleukin4,rmIL-4)在體外從骨髓中誘導(dǎo)擴(kuò)增出DC，觀察其形態(tài)學(xué)變化，用流式細(xì)胞儀對其表面分子CD80、CD40、CD86及33D1進(jìn)行鑒定，并比較這些分子在兩組之間表達(dá)水平的差異，非同位素的混合淋巴反應(yīng)測定其刺激同種異體T細(xì)胞的增殖能力；采用多探針的核酸酶保護(hù)分析(ribonucleaseprotectionassay,RPA)來檢測DC中細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄；

4、最后用凝膠電泳遷移率阻滯(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)來研究DC中核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)的活化情況，為了解DC在哮喘發(fā)病機(jī)理中的作用提供一定的分子基礎(chǔ)，為未來基于DC的哮喘治療提供新的思路。主要成果及結(jié)論如下： 1.哮喘鼠和對照鼠的骨髓細(xì)胞在含rmGM-CSF和rmIL-4的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，可從中誘導(dǎo)出大量的DC，第2天出現(xiàn)點(diǎn)狀集落、細(xì)胞呈圓

5、形，繼續(xù)培養(yǎng)，集落逐漸增多、細(xì)胞變大；第4天在倒置顯微鏡下可看到大小不一的樹突，有少數(shù)細(xì)胞開始懸?。恢恋?天，細(xì)胞大多懸浮，呈現(xiàn)DC的典型外形—樹突狀或星狀，分散于培養(yǎng)液中，輕輕吸出就可收集DC細(xì)胞。在顯微鏡下看到兩組鼠骨髓來源的DC均有大小不一的樹突，但在鏡下看不出二者樹突數(shù)目有明顯的差別。 2.流式細(xì)胞分析顯示，哮喘組和對照組骨髓來源的DC均表達(dá)DC分化相關(guān)抗原，CD40、CD80、CD86及小鼠DC的特異表面標(biāo)志33D1。

6、并且CD86分子的表達(dá)在兩組中間有差異，哮喘組高于對照組，而CD40、CD80、33D1的表達(dá)在兩組之間比較沒有差異性。 3.哮喘組和對照組DC都可以強(qiáng)烈刺激同種異體的T淋巴細(xì)胞的增殖，并且哮喘組DC刺激增殖能力明顯強(qiáng)于對照組，表明哮喘組DC的抗原遞呈能力明顯增強(qiáng)。在刺激同一細(xì)胞數(shù)時，隨DC數(shù)目的增多，刺激增殖的能力增強(qiáng)，并且在哮喘組中，不同的DC數(shù)量刺激T細(xì)胞增殖的能力也有明顯差異，而對照組卻沒有差異。 4.分析DC中

7、細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)，兩組DC均有IL-13、IL-9和IL-3mRNA的轉(zhuǎn)錄，且哮喘組中IL-13、IL-9mRNA的轉(zhuǎn)錄水平高于對照組，但I(xiàn)L-3mRNA的轉(zhuǎn)錄在兩組中卻無差異。 5.在兩組DC中均有NF-κB的活化，且在哮喘組中活化上調(diào)，這種活化程度的增加可能與DC的功能增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)。 從以上結(jié)果可以說明，確實從哮喘小鼠骨髓中誘導(dǎo)擴(kuò)增出了DC。在哮喘發(fā)病中，DC可能通過其表面分子CD86的差異表達(dá)，來增強(qiáng)抗原遞