TcpC調(diào)控樹突狀細(xì)胞作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的:
　　樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是迄今為止體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，廣泛分布于外周組織中。正常情況下體內(nèi)絕大多數(shù)DC都處于未成熟狀態(tài)，未成熟的DC可通過(guò)其表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、巨吞飲作用以及吞噬作用等方式攝取抗原，在攝取抗原后或受到某些刺激（如炎性信號(hào)LPS、IL-1β、TNF-α）后，未成熟的DC即開始分化成熟。DC的抗原提呈功能可直接或間接激活T、B細(xì)胞，因此DC在免疫應(yīng)答中占據(jù)

2、獨(dú)特地位，對(duì)DC的深入研究有助于我們了解機(jī)體免疫應(yīng)答的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，對(duì)腫瘤、移植排斥、感染、自身免疫病等發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療也具有重要的理論意義和實(shí)際意義。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是一類結(jié)構(gòu)功能較為明確的模式識(shí)別受體，在多種組織和細(xì)胞中廣泛分布，并且在一些固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、DCs中表達(dá)較高，TLRs可以通過(guò)識(shí)別并結(jié)合病原體的相關(guān)模式分子(pathogen associated molecu

3、lar pattern，PAMP)來(lái)活化免疫細(xì)胞并表達(dá)一系列的免疫效應(yīng)分子，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　尿路感染(urinary tract infection，UTI)是由各種病原體入侵泌尿系統(tǒng)、侵犯尿路黏膜或者尿路組織而引發(fā)的尿路炎癥，臨床特征一般表現(xiàn)為腰痛、尿頻、尿急、尿痛，引起泌尿系統(tǒng)炎癥的致病菌大部分為腸道的大腸埃希菌。針對(duì)尿路感染目前多采用抗生素類藥物進(jìn)行治療，但隨著病原菌耐藥性的增加給尿路感染的治療帶來(lái)

4、了極大挑戰(zhàn)。TcpC是由尿路致病性大腸埃希菌CFT073菌株分泌的一種含有TIR(Toll/interleukin-1 receptor)結(jié)構(gòu)域的蛋白，因其TIR結(jié)構(gòu)域與TLR的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似，因此TcpC可以直接與TLR信號(hào)通路的接頭蛋白髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)結(jié)合，從而阻斷TLR信號(hào)通路，干擾機(jī)體正常的免疫應(yīng)答。
　　目前關(guān)于TcpC干擾機(jī)體免疫應(yīng)答

5、的研究多集中于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及上皮細(xì)胞，尚無(wú)TcpC對(duì)樹突狀細(xì)胞分化和功能影響的研究報(bào)道。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，TcpC能夠抑制DC的分化成熟以及MHC(major histocompatibilitycomplex，MHC)Ⅱ類分子途徑對(duì)抗原的提呈。本課題擬研究TcpC調(diào)控樹突狀細(xì)胞的作用機(jī)制，旨在為進(jìn)一步闡明TcpC介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、 TcpC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)凍融已鑒定好的

6、含TcpC基因片段的工程菌E.coliBL21 pET42a-TcpC并劃線接種于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后從平板上挑取單個(gè)分離良好的、直徑約為2-3mm的白色半透明菌落于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取過(guò)夜后的菌液1ml并加至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6-0.8，加入IPTG，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)TcpC蛋白的表達(dá)。<

7、br>　　2、 TcpC蛋白的純化濃縮采用鎳柱分離純化、超濾管濃縮的方法。
　　3、兔抗TcpC多克隆抗體的制備將濃縮后的TcpC蛋白與弗氏佐劑及弗氏不完全佐劑等量混合乳化至“油包水”狀態(tài)，初次免疫之前要先進(jìn)行耳緣靜脈采血作為陰性對(duì)照，初次免疫之后的第三周開始加強(qiáng)免疫，每周一次共三次。末次免疫10天后先采少量血進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。
　　4兔抗TcpC多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定采用雙向瓊脂擴(kuò)散的方法進(jìn)行測(cè)定。
　　5兔抗TcpC多克

8、隆抗體的純化效價(jià)達(dá)到要求后，對(duì)家兔進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，收集獲得的血液并分離血清，再采用飽和硫酸銨法純化血清中的免疫球蛋白IgG。
　　6、兔抗TcpC多克隆抗體的特異性檢測(cè)Western blotting檢測(cè)制備的抗體對(duì)已純化的TcpC蛋白以及CFT073菌株分泌的TcpC天然蛋白的特異性，同時(shí)用TcpC基因敲除株TcpC-/-作為對(duì)照。
　　7、檢測(cè)DCs能否攝取TcpC蛋白收集DC2.4，洗滌后配成3×105 cells/m

9、l鋪于Transwell24孔板的下室，1ml/孔;上室加3×106個(gè)細(xì)菌（MOI=細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù)=10∶1）。以3種方式處理:空白對(duì)照組，即DC2.4組;DC2.4+TcpCwt組;DC2.4+TcpC-/-組，每組做3個(gè)復(fù)孔。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并獲取胞內(nèi)蛋白，用制備的兔抗TcpC多克隆抗體進(jìn)行western blotting檢測(cè)。
　　8、檢測(cè)TcpC蛋白進(jìn)入DCs胞內(nèi)后的作用機(jī)制收集DC2.4，洗滌后配成3×1

10、05cells/ml并鋪于Transwell24孔板的下室，1ml/孔;上室加3×106個(gè)細(xì)菌(MOI=細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù)=10∶1)。以3種方式處理:空白對(duì)照組，即DC2.4組;DC2.4+TcpCwt組;DC2.4+TcpC-/-組，每組做3個(gè)復(fù)孔。16h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并獲取胞內(nèi)蛋白，用MyD88及p65磷酸化抗體進(jìn)行western blotting檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、加入IPTG至終濃度為0.1mM，37℃2

11、20rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6-7h后TcpC目的蛋白即大量表達(dá)，并且主要以包涵體的形式表達(dá)。
　　2、咪唑濃度為2mM時(shí)即可將TcpC蛋白洗脫下來(lái)，將純化后的TcpC蛋白濃度濃縮至2mg/ml并對(duì)家兔進(jìn)行免疫。
　　3、采用雙向瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)為1∶8，對(duì)家兔進(jìn)行頸動(dòng)脈采血。
　　4、 Western blotting檢測(cè)抗血清對(duì)TcpC目的蛋白及天然蛋白均有單一清晰條帶，且對(duì)照株即TcpC基因敲除的菌株未見條帶。<

12、br>　　5、將DCs和細(xì)菌transwell隔開共培養(yǎng)不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)DCs胞內(nèi)的蛋白情況，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)8h時(shí)DCs胞內(nèi)即出現(xiàn)TcpC蛋白，隨時(shí)間變長(zhǎng)DCs胞內(nèi)的TcpC蛋白逐漸增多，至16h時(shí)達(dá)到最多，20h、24h時(shí)又出現(xiàn)減少情況。
　　6、將DCs和細(xì)菌transwell隔開共培養(yǎng)同時(shí)設(shè)置對(duì)照，發(fā)現(xiàn)與CFT073菌株共培養(yǎng)的DCs胞內(nèi)的MyD88蛋白及p-p65蛋白的量明顯低于空白對(duì)照組及與敲除株共培養(yǎng)的DCs。