Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為主要特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。較統(tǒng)一的觀點(diǎn)認(rèn)為哮喘是多種細(xì)胞如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞引起的慢性氣道炎癥。支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌物充滿氣道是哮喘患者急性發(fā)作的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在哮喘炎癥中T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制，Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-13、

2、IL-5和IL-9，其中IL-4和IL-13促使B細(xì)胞生產(chǎn)IgE，IL-5促進(jìn)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞的分化，IL-9能趨化肥大細(xì)胞并引起肥大細(xì)胞的分化，這些細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。但是，這個(gè)理論并不能完全解釋哮喘全部的病理生理過程。新近研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體存在一種新型的不同于1型和2型的效應(yīng)T細(xì)胞－輔助性17細(xì)胞（T help17，Th17）亞群。該細(xì)胞是由天然T細(xì)胞前體Th0分化而來，具有與Th1和Th2細(xì)胞不同的獨(dú)立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)

3、制，其在促炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。該細(xì)胞亞群能夠特異性地產(chǎn)生效應(yīng)因子白細(xì)胞介素（IL）-17，而不產(chǎn)生IFN-γ和IL-4，因此被稱為Th17亞群。由于具有促炎性作用，也被稱為炎癥性T細(xì)胞（inflammatory T cell）。Th17細(xì)胞亞群的分化和功能均受Th1和Th2細(xì)胞因子的調(diào)控。IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）聯(lián)合作用能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞，提示后者在哮喘等炎癥性疾病中同樣具有一定作用。

4、IL-17A是IL-17家族的一個(gè)特殊亞型，由Th17細(xì)胞亞群特異性產(chǎn)生，IL-17A由含有一個(gè)N-末端信號(hào)肽的155個(gè)氨基酸組成并由二硫鍵連接的同型二聚體糖蛋白。作為一種前炎癥因子，IL-17A可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增加表達(dá)多種細(xì)胞因子，如IL-6，IL-8，G-CSF，GM-CSF及粒細(xì)胞趨化蛋白-2（GCP-2），共同催化多種炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)浸潤(rùn)，這些細(xì)胞相互作用又可以分泌多種炎癥細(xì)胞因子，構(gòu)成炎癥細(xì)胞及炎癥因子之間的復(fù)

5、雜網(wǎng)絡(luò)，從而形成氣道的慢性炎癥。但對(duì)IL-17A及Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的了解還不多，本研究擬通過小鼠哮喘模型觀察Th17細(xì)胞和Th17細(xì)胞特異性產(chǎn)生的IL-17A在體內(nèi)的表達(dá)情況，初步探索Th17細(xì)胞和IL-17A在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。 第一部分小鼠哮喘模型的建立。 目的:探討建立OVA致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠哮喘模型。 方法: SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）24只，4

6、-6周齡，體重18～20g，隨機(jī)分為2組，每組12只，A組為正常對(duì)照組，B組為哮喘模型組。B組小鼠于實(shí)驗(yàn)流程第0、14d給予腹腔注射含OVA2mg和乳化的氫氧化鋁5mg的生理鹽水混懸液200μl致敏；第21d開始先給予1％OVA生理鹽水200μl滴鼻激發(fā)，隨后給予2％OVA生理鹽水霧化液40ml經(jīng)超聲霧化器霧化吸入，每天1次，每次持續(xù)約40min，連續(xù)6d。A組以生理鹽水代替致敏液及霧化液，方法同B組。在最后一次激發(fā)1h后，摘取小鼠眼球

7、放血后將其頸椎脫臼處死，兩組小鼠各隨機(jī)選取6只行支氣管肺泡灌洗術(shù)。將回收的BALF涂片，固定，HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)和分類的計(jì)數(shù)。細(xì)胞分類至少計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，求出各類細(xì)胞所占百分比。兩組小鼠各各隨機(jī)選取6只行開胸取肺組織，置于10％中性甲醛固定液中固定。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，拍片。 結(jié)果:

8、1.激發(fā)過程小鼠行為學(xué)觀察：模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的頭面部瘙癢，前肢搔鼻，煩躁不安，然后俯伏不動(dòng)，口唇紫紺，呼吸急促，腹肌抽搐，二便失禁等癥狀；而正常組小鼠無此癥狀。 2.BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類比較：①BALF細(xì)胞總數(shù)：A組BALF細(xì)胞總數(shù)為（0.62±0.43）×105/ml，B組BALF細(xì)胞總數(shù)為（1.41±0.13）×105/ml，B組BALF細(xì)胞總數(shù)顯著高于A組（P<0.01）。②BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率

9、：A組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率分別為0.83％±1.18％和5.67％±1.42％，B組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率分別為和25.42％±4.05％和29.63％±4.91％，B組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率顯著高于A組（P<0.01）。 3.肺組織病理觀察結(jié)果：哮喘模型組支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮損傷，結(jié)構(gòu)紊亂，氣道內(nèi)

10、杯狀細(xì)胞肥大增生，氣道內(nèi)分泌大量黏液并有粘液栓形成，粘膜下膠原纖維沉積。對(duì)照組肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰，氣道纖毛上皮排列整齊，無明顯的炎癥改變及膠原纖維沉積。 結(jié)論：BALB/c小鼠經(jīng)OVA和乳化的氫氧化鋁腹腔注射致敏后，采用滴鼻聯(lián)合霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型，更加符合哮喘氣道的病理生理改變。 第二部分 Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究。 目的:初步探索Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制。 方法:

11、30只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)均分為2組，每組15只，A組為正常對(duì)照組，B組為哮喘模型組。哮喘模型的制作過程同第一部分內(nèi)容。觀察2組小鼠BALF中細(xì)胞比例變化和氣道病理改變；外周血通過摘眼球采取，肝素化處理，胸腺及肺組織用眼科剪剪成小塊后，篩網(wǎng)上研磨成單個(gè)細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液，在外周血、胸腺細(xì)胞懸液和肺組織細(xì)胞懸液中分別加入適當(dāng)?shù)哪芫匾?，置?％的CO2、37℃孵育箱培養(yǎng)5h，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解、多聚甲醛固定、皂素破膜等處理后，

12、加入抗小鼠的FITC-CD4和PE-IL-17A抗體行細(xì)胞表面及胞內(nèi)抗原染色，最后加0.5ml染色液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血、胸腺和肺組織中Th17細(xì)胞。 結(jié)果:哮喘組BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。病理觀察可見哮喘組小鼠的氣道炎癥以中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而對(duì)照組無此變化。哮喘組外周血、脾臟及胸腺中Th17細(xì)胞（分別為3.62％±0.58％、4.22％

13、±0.69％、6.96％±1.35％）顯著增高，與對(duì)照組（分別為0.68％±0.26％、0.76％±0.31％、0.80％±0.30％）比較有顯著性差異（P<0.01）；而肺組織中Th17細(xì)胞很少，哮喘組（0.64％±0.30％）與對(duì)照組（0.55％±0.23％）相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。哮喘模型組血漿中Th17的水平與BALF中嗜中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)（分別為r=0.933，P=0.007：r=0.861，P=0.0

14、28）。 結(jié)論: Th17細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制，在哮喘中的作用可能是在胸腺分化成熟后，通過胸腺組織釋放入外周血及其它組織中，并且外周血Th17細(xì)胞與氣道嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)，從而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生，對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。 第三部分白介素-17A在哮喘小鼠中的表達(dá)及意義。 目的:初步探討哮喘小鼠中血清白介素（IL）-17A的水平及在其在肺、脾及胸腺組織中的表達(dá)情況。 方法:28

15、只BALB/c雌性SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組，14只）和哮喘模型組（B組，14只），哮喘模型的制作過程同第一部分內(nèi)容。觀察兩組小鼠氣道病理改變及BALF中各組細(xì)胞比例的變化；外周血通過摘眼球采取，肝素化處理，肺、脾及胸腺組織用眼科剪剪成小塊后，篩網(wǎng)上研磨成勻漿，外周血及肺、脾、胸腺組織懸液分別置于5％的CO2、37℃孵育箱培養(yǎng)24h后，以3000r/min離心10min，將上清液保存在-20℃冰箱用作IL-17A的測(cè)定。采用雙

16、抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)兩組小鼠血清IL-17A水平及肺、脾和胸腺組織勻漿預(yù)孵后的表達(dá)情況。 結(jié)果: B組BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均顯著高于A組（P<0.01）。病理觀察可見B組小鼠的氣道炎癥以中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而A組無此變化。IL-17A在A組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為10.94±5.02（×10pg/ml），13.63±4.07（×10

17、pg/g），16.37±9.85（×10pg/g），22.45±10.89（×10pg/g），IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為52.23±19.08（×10pg/ml），52.98±10.81（×10pg/g），54.77±10.80（×10pg/g），86.68±10.29（×10pg/g）。IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的表達(dá)水平顯著增高，與A組相比差異均有顯著性意義（P<0.01）