PAPP-A、IGF-I表達(dá)與動脈粥樣硬化相關(guān)功能的研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分：PAPP-A、IGF-I在ACS患者中的臨床意義 目的：檢測ACS患者外周血清PAPP-A、IGF-I濃度變化規(guī)律，探討它們在ACS發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：選取冠心病(CHD)病人93例，其中急性心肌梗死(AMI)病人30例，不穩(wěn)定性心絞痛(UAP)病人35例，穩(wěn)定性心絞痛(SAP)病人28例，同時選取冠脈造影正常對照30例。用冠脈造影法確定病例分組正確。ACS組采血時間于發(fā)病后1

2、2h內(nèi)，SAP組及對照組患者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5ml，入院24h內(nèi)常規(guī)測定cTnT、CRP、血脂、血糖。采用德國DRG公司超敏妊娠相關(guān)血漿蛋白A(US-PAPP-A)ELISA試劑盒測定PAPP-A濃度。采用上海森雄科技實業(yè)公司的人IGF-I酶聯(lián)免疫試劑盒，測定IGF-I濃度。各組間進(jìn)行比較并進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果： 1、各組間PAPP-A、IGF-I、CRP、cTnT濃度經(jīng)單因素方差分析均有統(tǒng)計學(xué)差異(P值均

3、<0.05)。經(jīng)LSD法多重比較，ACS組PAPP-A、IGF-I、CRP均顯著高于SAP組和對照組(P<0.01)；SAP組PAPP-A、CRP較對照組無顯著性差異(P>0.05)，SAP組IGF-I顯著低于對照組(P<0.01；P<0.01)。AMⅠ組cTnT均顯著高于UA組、SAP組和對照組。UA組、SAP組和對照組間cTnT無顯著性差異(P>0.05)。 2、AMⅠ組中：PAPP-A與CRP呈正相關(guān)(γ=0.415，P=

4、0.023)，IGF-I與CRP呈正相關(guān)(γ=0.513，P=0.004)PAPP-A與IGF-I呈正相關(guān)(γ=0.379，P=0.039)；PAPP-A、IGF-I及CRP與cTnT之間均無相關(guān)性(P值均>0.05)。 3、UAP組中：PAPP-A與IGF-I呈正相關(guān)(γ=617，P=0.000)，IGF-I與CRP呈正相關(guān)(γ=0.471，P=0.004)PAPP-A與CRY呈正相關(guān)(γ=0.509，P=0.002)；PAP

5、P-A、IGF-I及CRP與cTnT之間均無相關(guān)性(P>0.05)。 3、在SAP組及對照組中，PAPP-A、IGF-I、CRP、cTnT之間無顯著性相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。 結(jié)論： 1、PAPPP-A、IGF-I在ACS發(fā)生機(jī)制中可能發(fā)揮一定作用。 2、二者濃度升高在臨床上可以提示動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性。 第二部分：AS易損斑塊模型的建立及其易損斑塊內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞學(xué)功能 目的

6、：研究PAPP-A在兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型中胸主動脈中的表達(dá)差異，以及在兔動脈粥樣硬化模型中動脈粥樣硬化易損斑塊培養(yǎng)出的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)的表達(dá)，同時比較不同血管組織來源VSMCs的細(xì)胞學(xué)功能。 方法：利用球囊損傷后給予高脂飼養(yǎng)12周，以中國斑點蝰蛇毒(CRVV)和組胺藥物觸發(fā)，建立新西蘭兔動脈粥樣硬化模型并造成實驗性易損斑塊破裂模型。通過組織學(xué)HE染色觀察大體標(biāo)本，細(xì)胞免疫組化

7、的方法檢測PAPP-A的表達(dá)，并確定表達(dá)部位。進(jìn)一步于體外培養(yǎng)來源于兔主動脈正常組織、動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊及易損斑塊組織的VSMCs。RT-PCR檢測這兩個不同來源VSMCs中PAPP-A的mRNA表達(dá)水平；細(xì)胞免疫組化方法檢測PAPP-A的蛋白表達(dá)，并確定表達(dá)部位。利用MTT法測定細(xì)胞生長曲線，采用劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1、PAPP-A在血管內(nèi)膜及中膜均有表達(dá)。PAPP-A陽性物質(zhì)主

8、要位于易損斑塊的血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞細(xì)胞胞漿。在30例粥樣斑塊中，內(nèi)膜PAPP-A陽性率為60％，其中穩(wěn)定斑塊陽性率為33.33％，易損斑塊中PAPP-A陽性率為100％；兩組間比較PAPP-A表達(dá)陽性率有顯著性差異(P<0.01)。中膜PAPP-A總陽性率為70％，穩(wěn)定斑塊陽性率為50.00％，易損斑塊PAPP-A陽性率為100％。兩組間比較PAPP-A表達(dá)陽性率有顯著性差異(P<0.05)。 2、PAPP-A的

9、mRNA相對表達(dá)量(PAPP-A/β-actin)，穩(wěn)定斑塊VSMCs僅為易損斑塊VSMCs表達(dá)的37％，差異有顯著性(P<0.01)。模型兔的正常VSMCs及正常兔VSMCs無表達(dá)。 3、來源于制模新西蘭白兔正常胸主動脈組織的VSMCs，PAPP-A表達(dá)為陰性。易損斑塊來源VSMCs表現(xiàn)強陽性占76％，而穩(wěn)定斑塊來源VSMCs強陽性細(xì)胞數(shù)量為25％。二者相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 4、正常血管組織來源的V

10、SMCs生長速度比易損斑塊來源的VSMCs和穩(wěn)定斑塊來源的VSMCs明顯減慢，而易損斑塊來源的VSMCs生長速度較穩(wěn)定斑塊來源的VSMCs的慢，但二者無統(tǒng)計學(xué)意義。易損斑塊來源的VSMC細(xì)胞凋亡比正常VSMC細(xì)胞增多，提示PAPP-A強陽性表達(dá)的VSMCs，細(xì)胞凋亡強于PAPP-A陰性表達(dá)的。細(xì)胞遷移能力的測定結(jié)果提示正常來源的血管平滑肌細(xì)胞運動能力低；易損斑塊VSMC細(xì)胞較穩(wěn)定斑塊來源的VSMC細(xì)胞遷移能力差。但二者不具統(tǒng)計學(xué)意義。

11、 結(jié)論: 1、PAPP-A在構(gòu)建的兔動脈粥樣硬化易損斑塊中大量表達(dá)。 2、在易損斑塊的血管平滑肌細(xì)胞強烈表達(dá)PAPP-A。 3、易損斑塊的血管平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)功能改變，為進(jìn)一步的研究PAPP-A在ACS中的作用機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。 第三部分：人IGF-I基因慢病毒介導(dǎo)RNA干擾有效靶點的設(shè)計及篩選 目的：設(shè)計并篩選人IGF-I有效RNA干擾片段，構(gòu)建IGF-I-siRNA慢病毒表達(dá)

12、載體。 方法：使用Invitrogen公司專用shRNA軟件對IGF-I基因編碼區(qū)分析、篩選符合公開文獻(xiàn)篩選參數(shù)的序列4條，以及陰性對照序列1條，由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成。 結(jié)果： 1、成功地合成四條編碼發(fā)夾siRNA序列的單鏈DNA，并將其克隆到pGCSIL-GFP載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PscSI-1、2、3、4，并按相同方法合成無關(guān)基因的重組質(zhì)粒PSC-NC，酶切鑒定和測序證實載體構(gòu)建成功。 2、

13、Realtime-PCR檢測IGF-I的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒PscSI-1轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后IGF-ImRNA表達(dá)最低，重組質(zhì)粒PSC-NC轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)IGF-ImRNA的表達(dá)量與空白對照的水平接近(P>0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了小的發(fā)夾式IGF-I慢病毒表達(dá)載體。 2、在人IGF-I序列位點1010～1028bp、序列為ACCTTCTAAGTGGTTTA可以在H1299細(xì)胞中實現(xiàn)對人IGF-I

14、基因的表達(dá)的有效沉默。 第四部分：PAPP-A、IGF-I的表達(dá)對hCASMCs生物學(xué)功能的影響 目的： 1、利用篩選到IGF-I慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染hCASMCs、檢測IGF-I基因表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)特性。 2、體外觀察PAPP-A、IGF-I表達(dá)與炎癥因子的關(guān)系。 3、觀察IL-1β、TNF-α、IGFBP4對IGF-I基因沉默的hCASMCs細(xì)胞學(xué)功能的影響。 方法：針對IGF-I基因的

15、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)真核轉(zhuǎn)染hCASMCs后，用Realtime-PCR和ELISA檢驗干擾效果，并進(jìn)一步利用MTT法、流式細(xì)胞儀方法研究IGF-I對hCASMCs的生物學(xué)特性的影響。 結(jié)果： 1、RNAi后發(fā)現(xiàn)hCASMCs中IGF-I在mRNA水平及蛋白表達(dá)均有顯著下降。 2、提示RNAi沉默IGF-I表達(dá)可促進(jìn)hCASMCs的細(xì)胞凋亡。 3、TNF-α、IL-1β對

16、hCASMCs刺激8小時PAPP-A表達(dá)量最高，其次為16小時和24小時，1小時最低。 4、TNF-α+IL-β或TNF-α+IL-1β+IGFBP4刺激空白對照組細(xì)胞、陰性對照組細(xì)胞、RNAi組細(xì)胞時hCASMCs中PAPP-A均有較強表達(dá)，在RNAi組的hCASMCs中PAPP-A的表達(dá)量少于另外兩組。 5、在TNF-α+IL-1β+IGFBP4刺激空白對照組細(xì)胞、陰性對照組細(xì)胞、RNAi組細(xì)胞中IGF-I表達(dá)量明顯

17、高于僅用TNF-α+IL-1β刺激的和未行刺激的，并具有統(tǒng)計學(xué)意義。 6、MTT結(jié)果示INF-α+IL-1β或TNF-α+IL-1β+IGFBP4刺激時空白對照組細(xì)胞、陰性對照組細(xì)胞和RNAi細(xì)胞增殖活力(OD570值)有統(tǒng)計學(xué)差異。 7、空白對照組細(xì)胞、陰性對照組細(xì)胞和RNAi組細(xì)胞在無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)12h處理后檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)論： 1、慢病毒介導(dǎo)的發(fā)夾式IGF-I-PscSI-1-hCAS