養(yǎng)殖刺參（Apostichopus japonicus）潰瘍病病原菌致病性研究.pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus)是滋補(bǔ)和藥用的精品，20世紀(jì)90年代末在我國(guó)的山東和遼寧兩省掀起了刺參人工養(yǎng)殖的熱潮，刺參已成為推動(dòng)我國(guó)北方沿海養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的新興養(yǎng)殖品種。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，刺參病害也日益顯著，自2003年起，各地的養(yǎng)殖刺參頻發(fā)潰瘍病，嚴(yán)重制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展。因此進(jìn)行刺參潰瘍病流行病學(xué)及致病機(jī)理的研究成為迫在眉睫的課題。本研究從患潰瘍病刺參病灶處分離到2株優(yōu)勢(shì)菌(H1和RH2)，人工感染實(shí)

2、驗(yàn)證實(shí)2株菌均具有致病性，其中H1為強(qiáng)毒力菌株，RH2為弱毒力菌株，并在此基礎(chǔ)上對(duì)2株病原菌進(jìn)行了鑒定。提取強(qiáng)毒力菌株H1的胞外產(chǎn)物(extracellularproducts,ECP)，并對(duì)ECP的致病性、含有的酶種類(lèi)、酶比活力、蛋白組成以及抗原性等特性進(jìn)行了分析。利用凝膠排阻層析和陰離子交換層析從ECP中分離純化出一種絲氨酸蛋白酶，致病性實(shí)驗(yàn)證明其為菌株H1的毒力因子，從生物酶學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)角度對(duì)該蛋白酶的特性進(jìn)行了分析。具體方法和

3、結(jié)果如下： 2005年3月，山東省乳山刺參養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生大規(guī)模刺參潰瘍病，癥狀為厭食、體表潰瘍、腫嘴、吐腸、最后自溶死亡。從患潰瘍病刺參病灶處分離到2株優(yōu)勢(shì)菌(H1和RH2)，采用浸浴、創(chuàng)傷浸浴、體腔注射和體壁肌肉注射等4種方式對(duì)刺參進(jìn)行感染，結(jié)果證明2株菌均具有致病性，其中H1為強(qiáng)毒力菌株，可通過(guò)體壁創(chuàng)傷浸浴和體壁肌肉注射方式感染刺參，且在水溫較低時(shí)毒力較強(qiáng)，對(duì)刺參的半致死濃度(LD50)高達(dá)1.4×106CFU/尾；RH2為弱毒

4、力菌株，僅能以體壁肌肉注射方式感染刺參，其對(duì)刺參的半致死濃度(LD50)為5.7×106CFU/尾。 常規(guī)生理生化指標(biāo)鑒定菌株H1為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種(Aeromonassalmonicida masoucida)，菌株RH2為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；在此基礎(chǔ)上測(cè)定了菌株RH2的16S rRNA基因序列和熱激蛋白HSP60(Heat shock protein，HSP)基因序列，在NCBI上進(jìn)

5、行同源性檢索并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示在以16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中菌株RH2與Valginolyticus(AF513447)自然聚合，置信度為50％，而在以HSP60基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中菌株RH2與V.alginolyticus(AY332570、AF230931)聚為一個(gè)分支，置信度高達(dá)99％。 采用玻璃紙平板法提取強(qiáng)毒力菌株H1的胞外產(chǎn)物(ECP)，其能夠引起刺參死亡，癥狀與自然發(fā)病者相似，對(duì)刺參的半致

6、死量為5.24μg蛋白/g體重：ECP中具有酪蛋白酶、明膠蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和淀粉酶活性，并具有溶血性；通過(guò)對(duì)底物azocasin作用的情況來(lái)檢測(cè)ECP的蛋白酶活性，作用溫度為25℃時(shí)其酶比活力為470.6活力單位/mg蛋白，其與底物的最適作用溫度為50℃，且對(duì)熱不穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，酶活呈下降趨勢(shì)，超過(guò)70℃時(shí)，酶即被滅活。用SDS-PAGE對(duì)ECP結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)組成ECP的蛋白有大約13條蛋白帶，其中主要條帶有9條；利用鼠抗

7、ECP血清進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果顯示ECP的13條蛋白帶中有7條具有免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答分泌抗體。 利用Sephadex G-100凝膠排阻層析和DEAE陰離子交換層析對(duì)ECP中的毒力因子進(jìn)行純化，結(jié)果得到一種分子量為42 kDa的蛋白酶，其能夠引起刺參死亡，癥狀與菌株H1引發(fā)刺參死亡的癥狀相似，對(duì)刺參的半致死量為1.12μg/g體重，是ECP毒力的4.7倍，表明該蛋白酶為菌株H1的毒力因子。從培養(yǎng)

8、上清開(kāi)始，經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟的純化蛋白酶的產(chǎn)率為1.7％，而其酶比活力增加了21.9倍。該蛋白酶與底物的最適作用為40℃，最適作用pH為8.0，對(duì)熱不穩(wěn)定，70℃時(shí)即被滅活：蛋白酶可被5 mM的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF抑制98％的酶活，Ca2+和Mg2+可分別提高9％和3％的酶比活力。測(cè)定蛋白酶N末端15個(gè)氨基酸殘基序列，NCBI同源檢索結(jié)果顯示與絲氨酸蛋白酶同源性最高。蛋白酶的雙向電泳顯示分子量為42 kDa的蛋白酶是由等電點(diǎn)偏堿性的兩種