獼猴桃潰瘍病相關(guān)細菌的鑒定及致病性研究.pdf

1、獼猴桃潰瘍病是一種世界性的侵染獼猴桃的細菌性病害,該病害危害極大,嚴重時可致使全園毀滅,造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病害在中國、日本、韓國、意大利、新西蘭等主要獼猴桃種植國家均有發(fā)生。目前獼猴桃潰瘍病在我國獼猴桃產(chǎn)區(qū)的發(fā)生呈上升趨勢,個別年份甚至大流行。由于我國對獼猴桃潰瘍病的病原缺乏系統(tǒng)的研究,因此,本研究分別在安徽、陜西、重慶等地獼猴桃果園重病區(qū)采集病樣,對該病害的相關(guān)細菌進行了分離,并對其做了表型鑒定、分子特征分析以及致病性測定等研究。

2、主要研究結(jié)果如下:
　　1.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細菌的分離及表型鑒定本研究采用研磨稀釋分離法分別用三種培養(yǎng)基對采集的病樣進行分離,共得到328株出現(xiàn)頻率高并具有代表性的菌株,這些菌落在BPA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的形態(tài)有三類:一類是菌落呈白色,圓形隆起,邊緣呈光滑的波浪狀,共311株。其中有282株革蘭氏染色為陰性,能動,好氧,LOPAT試驗為(++–++),七葉苷水解和明膠液化試驗為陽性,能利用葡萄糖產(chǎn)酸,能利用葡萄糖,蔗糖,海藻糖,纖維二糖

3、,乳糖,麥芽糖,并且能在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)熒光色素,初步鑒定為熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens。另29株革蘭氏染色為陰性,兼性厭氧,能動,LOPAT試驗為(+–––+),產(chǎn)熒光色素試驗、明膠液化試驗均為陰性,過氧化氫酶反應(yīng)和七葉苷水解試驗為陽性。第二類是菌落黃色,圓形光滑,全緣。第三類是菌落初呈乳白色,后產(chǎn)生黃色素,菌落生長快。
　　2.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細菌的分子特征分析
　　利用丁香假單胞獼猴桃致病變種

4、的特異性引物PsaF1/R2、PsaF3/R4,對125株細菌的全基因組DNAITS區(qū)域進行雙重PCR擴增,凝膠電泳檢測結(jié)果表明僅意大利提供的P.syringaepv.actinidiae菌株F285、Fc84、F28c在175bp和280bp左右的位置檢測到兩條擴增片段,分離所得細菌均未檢測到目的片段。
　　利用細菌16SrRNA片段通用引物P1F/P2R,對125株細菌全基因組DNA做PCR擴增,均得到一條大小約為1500bp

5、目的片段,分別用限制性內(nèi)切酶HaeIII和MSPI對16SrRNA-PCR擴增片段酶切,酶切圖譜顯示,內(nèi)切酶HaeIII將菌株分為四類,MSPI將菌株分為五類,酶切結(jié)果與菌株的表型鑒定結(jié)果大體一致。選取14株代表性細菌,將其16SrRNA-PCR擴增片段進行T/A克隆、序列測定,對獲得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索,結(jié)果顯示意大利提供的P.syringaepv.actinidiae菌株F285、Fc84、F28c的16SrRN

6、A片段與P.s.pv.actinidiae同源性達99％,菌株AHK-1、AHK-2、A1-3、A2-1、A2-2與P.fluorescens同源性達99%,菌株A17、F-7與Rahnellaspp.同源性達99%,菌株C101、AL-3與Xanthomonaspp.同源性達99%,菌株B-2、C-3與Pantoeaagglomerans同源性達99%。
　　采用假單胞菌屬ITS間隔區(qū)通用引物D21/D22,對14個代表性細菌全

7、基因組DNA進行PCR擴增結(jié)果表明:P.s.pv.actinidiae和P.fluorescens在600bp左右的位置檢驗出單一條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。Rahnellaspp.,Xanthomonaspp.和Pantoeaagglomerans進行ITS序列的PCR擴增未檢測到目標片段。將假單胞屬細菌ITS區(qū)域擴增片段進行T/A克隆測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對,結(jié)果顯示AHK-1,AHK-5A1-3,A2-1,A2-2菌株的rRNA

8、-ITS序列與P.fluorescens菌株A506,62e和2313的同源性高達97%~99%,菌株F285、Fc84、F28c的rRNA-ITS序列與P.s.pv.actinidiae菌株P(guān)A835和Kw-11的同源性為99%。對獲得序列與已知細菌的ITS序列進行聚類分析,結(jié)果顯示P.fluorescens和P.syringae,P.avellanae屬不同的分支(89%bootstrapsupport),而本實驗分離所得的Pseu

9、domonas菌株與P.fluorescens緊密相鄰(95%bootstrapsupport),意大利提供的P.s.pv.actinidiae菌株與P.s.pv.actinidiae相近(63%bootstraplevel)。
　　3.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細菌的致病性測定將14個代表性細菌菌株制成107~108CFU/mL菌懸液,分別接種煙草葉片、離體健康獼猴桃植株的1~2年生枝條、嫩梢以及活體獼猴桃植株的嫩梢和葉片。觀察發(fā)現(xiàn),除P

10、antoeaagglomerans引起的煙草葉片過敏性反應(yīng)較弱,其它菌株包括Rahnellaspp.,Xanthomonasspp.,P.fluorescens和P.s.pv.actinidiae均能引起煙草葉片產(chǎn)生過敏性枯斑;但是僅只有P.fluorescens和P.s.pv.actinidiae菌株能引起獼猴桃枝條、嫩梢以及葉片發(fā)病,其他菌株與無菌水對照接種部位無明顯發(fā)病癥狀,通過柯赫氏法則驗證,從發(fā)病的組織上成功分離到P.fluo