水稻類受體胞質(zhì)激酶STRK1調(diào)節(jié)鹽脅迫的分子遺傳及生化分析.pdf

1、土壤鹽漬化是危害水稻（Oryza sativa L.）生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的一個(gè)重要的環(huán)境因素。土壤中高濃度的鹽分會(huì)使離子失衡、水分虧缺、氧化傷害，并導(dǎo)致生物大分子被破壞、生長(zhǎng)遲緩、甚至植株死亡。植物中的類受體蛋白激酶(Receptor-likekinases，RLKs)，是一類定位于細(xì)胞膜，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域組成，通過(guò)胞外結(jié)構(gòu)域感受外界環(huán)境脅迫信號(hào)，并通過(guò)胞內(nèi)激酶域催化靶蛋白的磷酸化，啟動(dòng)相應(yīng)的生理生化等適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)降低或

2、消除危害，因此RLKs在植物的逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。植物中類受體胞質(zhì)激酶(Receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs)是一類沒(méi)有胞外結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶，屬于RLKs超家族。目前的研究顯示水稻中許多RLCK的表達(dá)受非生物脅迫的調(diào)節(jié)，但只有極少數(shù)的RLCK被報(bào)道參與非生物脅迫反應(yīng)，并且其參與非生物脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制也并不十分清楚。本研究中，通過(guò)芯片篩選受鹽誘導(dǎo)的部分水稻RLKs

3、基因，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，確定了6個(gè)受鹽誘導(dǎo)的RLKs基因，并構(gòu)建它們的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過(guò)鹽脅迫處理篩選T2代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因幼苗的表型，鑒定到了一個(gè)正調(diào)控水稻鹽脅迫的RLCK基因STRK1(salt tolerance receptor-like cytoplasmic kinase1)，并對(duì)其正調(diào)控水稻鹽脅迫的分子機(jī)理進(jìn)行了研究。論文的具體研究結(jié)果如下:
　　(1)在幼苗期和生殖生長(zhǎng)時(shí)期，過(guò)量表達(dá)STRK1增加了轉(zhuǎn)

4、基因植株對(duì)鹽脅迫的耐受性，而STRK1干擾植株則對(duì)鹽敏感。鹽脅迫條件下，與野生型相比，過(guò)量表達(dá)STRK1降低了轉(zhuǎn)基因幼苗的丙二醛(MDA)含量和相對(duì)電導(dǎo)率大小，表明在鹽脅迫條件下STRK1能降低膜的氧化損傷。同時(shí)，鹽脅迫處理下，STRK1轉(zhuǎn)基因植株的有效穗與野生型的相比沒(méi)有明顯變化，但是STRK1過(guò)表達(dá)植株的小穗育性和產(chǎn)量比野生型的高，而STRK1干擾植株的小穗育性和產(chǎn)量比野生型的低，說(shuō)明鹽脅迫條件下STRK1的過(guò)表達(dá)改善了轉(zhuǎn)基因水稻的

5、產(chǎn)量。
　　(2) STRK1屬于RLCK，但是亞細(xì)胞定位顯示STRK1定位于細(xì)胞膜，當(dāng)把STRK1蛋白N端的3個(gè)半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼釙r(shí)(STRK1-C5，10，14A-YFP)，STRK1則定位于細(xì)胞質(zhì)，說(shuō)明STRK1可能被棕櫚?；揎椂^定于細(xì)胞膜。與野生型相比，35S::STRK1-YFP的轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫的耐受性，而35S::STRK1-C5，10，14A-YFP的轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽脅迫能力與野生型相比無(wú)明顯變化

6、，說(shuō)明膜定位對(duì)STRK1傳遞鹽信號(hào)是必需的。STRK1的表達(dá)能被NaCl和H2O2處理所誘導(dǎo)。STRK1pro::GUS轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STRK1主要在幼根，葉脈，莖、4天的幼苗、葉鞘和幼穗中表達(dá)。
　　(3)酵母雙雜交和BiFC實(shí)驗(yàn)證明STRK1與水稻CATs家族蛋白（CatA、CatB和CatC）能相互作用。β-半乳糖苷酶活性分析顯示STRK1與CatC的相互作用強(qiáng)于與CatA和CatB的。Pull-down和

7、Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了STRK1與CatC的相互作用。在體外STRK1能磷酸化CatC，并激活CatC的酶活性，并且STRK1磷酸化CatC的加強(qiáng)依賴于STRK1被NaCl的激活。同時(shí)CatC的酶活性與與它的磷酸化程度呈正相關(guān)。
　　(4)為了研究STRK1對(duì)水稻過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響，我們檢測(cè)了野生型和STRK1轉(zhuǎn)基因植株CAT的酶活性及H2O2的含量。鹽脅迫條件下，與野生型相比，STRK1的過(guò)表達(dá)能增加轉(zhuǎn)基因植株中

8、CAT酶活并降低H2O2的含量，而STRK1的干擾能降低轉(zhuǎn)基因植株中CAT酶活并增加H2O2的含量。這些結(jié)果說(shuō)明STRK1通過(guò)調(diào)節(jié)CAT的酶活進(jìn)而調(diào)控H2O2的平衡來(lái)增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受性。
　　(5)為了研究STRK1對(duì)氧化脅迫的影響，我們用MV處理野生型和轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，在MV處理下，與野生型相比，STRK1的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)植株中CAT的酶活性，提高苗長(zhǎng)和葉綠素含量，而干擾其表達(dá)則會(huì)使植株中CAT的酶活性減弱，苗長(zhǎng)和葉綠素含量降低