水稻類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1胞外本體篩選.pdf

1、類(lèi)受體蛋白激酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育、組織形成和器官發(fā)育、抗逆抗病中都發(fā)揮著重要的作用。對(duì)類(lèi)受體蛋白激酶相應(yīng)配體的研究是揭示其生物學(xué)功能和分子作用機(jī)制的重要方面。
　　 本文旨在對(duì)一個(gè)新的水稻類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1的胞外配體進(jìn)行初步篩選。為此構(gòu)建了人工融合蛋白OsRPK1-XA21，以配體與OsRPK1胞外LRR區(qū)相互作用誘發(fā)XA21胞內(nèi)激酶區(qū)介導(dǎo)的超敏反應(yīng)作為篩選依據(jù)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的死亡率、活性氧爆發(fā)和抗病相關(guān)基因表達(dá)來(lái)判斷篩選工

2、作是否成功。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中開(kāi)展了鹽脅迫下水稻質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了一批鹽脅迫響應(yīng)蛋白，其中包括一個(gè)分子量98 kDa，等電點(diǎn)5.93的蛋白，將其命名為OsRPK1。后期研究發(fā)現(xiàn)，OsRPK1參與生長(zhǎng)素的識(shí)別和極性運(yùn)輸，并在2，4-D誘導(dǎo)下表達(dá)量持續(xù)增加。于是我們?cè)O(shè)想，2，4-D可能作為OsRPK1的胞外配體與OsRPK1相互作用才導(dǎo)致了上述的結(jié)果出現(xiàn)。
　　 Xa21是抗水稻白葉枯病致病菌(Xantho

3、monas oryzae pv.oryzae，Xoo)基因家族成員，研究表明，攜帶有Xa21的水稻品種在受到白葉枯病菌侵害時(shí)，可以引發(fā)強(qiáng)烈的抗性反應(yīng)即超敏反應(yīng)，局部組織壞死阻擋了病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散。超敏反應(yīng)屬于細(xì)胞程序性死亡，包括一系列的生理生化指標(biāo)如細(xì)胞活力喪失、活性氧爆發(fā)、抗性基因啟動(dòng)表達(dá)等，這些指標(biāo)被廣泛用作判斷植物是否發(fā)生超敏反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)將類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1-LRR+TM與Xa21-JM+KD以及OsRPK1-LR

4、R+TM+JM與Xa21-KD進(jìn)行融合，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行水稻日本晴愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)抗性愈傷組織培養(yǎng)帶有融合蛋白的水稻懸浮細(xì)胞。在抗性懸浮細(xì)胞中添加不同濃度的生長(zhǎng)素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxy acetic acid，2，4-D)后，檢測(cè)懸浮細(xì)胞死亡率、懸浮細(xì)胞活性氧爆發(fā)和植物抗病相關(guān)基因OsPR1a的表達(dá)狀況。
　　 在轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞中加入0μM、0.1μM、1μM和20μM

5、2，4-D為試驗(yàn)組，以野生型粳稻日本晴懸浮細(xì)胞作為陰性對(duì)照。測(cè)定細(xì)胞染料結(jié)合率即死亡率、培養(yǎng)基中H2O2含量和OsPR1a基因半定量分析。相比陰性對(duì)照而言，AN19和B912的死亡率升高、培養(yǎng)基H2O2在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)、抗性基因OsPR1a的表達(dá)量半定量也在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明:2，4-D與OsRPK1胞外LRR區(qū)發(fā)生了相互作用，2，4-D與OsRPK1胞外LRR區(qū)結(jié)合后激活了融合蛋白中XA21激酶區(qū)的活性，從而引發(fā)了

6、XA21觸發(fā)的超敏反應(yīng)。通過(guò)本研究工作，初步確定了外源生長(zhǎng)素2，4-D做為OsRPK1的胞外配體與OsRPK1發(fā)生相互作用，建立了OsRPK1配體篩選模型;我們的結(jié)果也初步說(shuō)明，植物類(lèi)受體蛋白激酶近膜區(qū)在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮了重要的信號(hào)傳遞作用，只要近膜區(qū)關(guān)鍵氨基酸不發(fā)生改變，其來(lái)源并不影響信號(hào)的傳遞，LRR區(qū)與特異配體結(jié)合后發(fā)出的信號(hào)都可使激酶區(qū)激活，開(kāi)啟下游信號(hào)通路。
　　 上述結(jié)果為進(jìn)一步全面分析OsRPK1參與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的