水稻CDPK家族基因結(jié)構(gòu)、鹽脅迫下的表達特性和重要基因遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、CDPK是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，在介導(dǎo)植物生育信號和逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。迄今，有關(guān)水稻CDPK的研究尚缺乏系統(tǒng)報道。鑒于此，本項研究通過對水稻基因組搜索，獲得了22個水稻CDPK基因。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，研究了上述水稻CDPK基因的結(jié)構(gòu)特征、在鹽分逆境脅迫條件下的時空表達特性和部分基因啟動子及基因的功能。主要研究結(jié)果如下: 1、水稻CDPK基因(OsCDPK1～OsCDPK4、OsCDP

2、K6～OsCDPK21、OsCDPK23、OsCDPK24)在基因結(jié)構(gòu)特征上存在明顯差異。各基因成員在DNA序列長度、eDNA全長序列、開放閱讀框和翻譯的氨基酸數(shù)量上變幅較大。聚類分析發(fā)現(xiàn)，水稻CDPK基因可劃分為2個亞組。 2、部分水稻CDPK基因在正常生長條件和鹽分脅迫條件下表現(xiàn)為組成型表達，包括OsCDPK4、OsCDPK18、OsCDPK19和OsCDPK24；OsCDPK10和OsCDPK16在根葉中表達受到鹽分脅迫的

3、調(diào)控。OsCDPK6，OsCDPK20和OsCDPK13在鹽分處理后表現(xiàn)為葉片中特異上調(diào)表達。對OsCDPK6和OsCDPK20的表達隨鹽分處理時間的變化研究發(fā)現(xiàn)，上述基因的表達均表現(xiàn)為單峰曲線特征，以處理1h表達水平最高。表明水稻許多CDPK基因介導(dǎo)了鹽分脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 3、在克隆OsCDPK19啟動子的基礎(chǔ)上，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了由OsCDPK19啟動子驅(qū)動報告基因(β-葡萄糖醛酸酶基因，GUS)表達的表達載體p

4、CAM3301-OsCDPK19。對遺傳轉(zhuǎn)化后的煙草研究發(fā)現(xiàn)，OsCDPK19啟動子能驅(qū)動報告基因高水平表達，且表現(xiàn)為葉片和莖桿維管組織優(yōu)勢表達的特征。研究表明，在-296bp～-623 bp和-623 bp～-989 bp，具有增強子的存在；在-989 bp～-1474 bp中的AC-Ⅱ、AC-Ⅲ元件相似的基序(分別為ACCAACC和GTTAGGT)，可能是調(diào)控下游基因呈維管組織中優(yōu)勢表達的調(diào)控元件。 4、由于OsCDPK6基

5、因在葉片中的表達受到鹽分脅迫的明顯誘導(dǎo)，表明該基因可能介導(dǎo)葉片中鹽分脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程?；诖耍髡咄ㄟ^農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，建立了超表達OsCDPK6基因的煙草轉(zhuǎn)基因系。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽分脅迫條件下，上調(diào)表達OsCDPK6的轉(zhuǎn)基因煙草植株，與對照相比耐鹽能力明顯改善。表現(xiàn)為經(jīng)過7 d的鹽分處理后，轉(zhuǎn)基因系植株較對照植株傷害小、單株綠葉面積多。與對照相比，轉(zhuǎn)基因系葉片的SOD活性增加，丙二醛(MDA)含量降低；葉綠素a、b含量、類胡蘿卜

6、素含量、可溶性糖含量和可溶蛋白含量明顯增加。表明植株細胞保護代謝途徑響應(yīng)了OsCDPK6介導(dǎo)的鹽分逆境信號過程。OsCDPK6在增強植株抵御鹽分脅迫的能力中具有較重要的作用。 5、OsCDPK6在葉片中的表達表現(xiàn)為明顯的鹽分誘導(dǎo)特性，推測該基因的啟動子具有驅(qū)動下游基因在鹽分脅迫條件下增強表達的功能，在作物耐鹽轉(zhuǎn)基因品種的創(chuàng)制中具有重要價值?；诖耍髡邔sCDPK6基因的啟動子進行了克隆，采用基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，在煙草中鑒定了該

7、啟動子的功能和驅(qū)動靶基因的表達特征。研究表明，遺傳轉(zhuǎn)化OsCDPK6啟動子的轉(zhuǎn)基因植株，根和葉進行X-gluc組織化學(xué)染色的特征，與對OsCDPK6基因在正常生長和鹽分處理條件下水稻根、葉中的表達特征相一致。鹽分處理后在莖、葉的組織染色程度較對照明顯加深，驅(qū)動報告基因的表達為組成型。在OsCDPK6的啟動子中，含有1個MYC轉(zhuǎn)錄因子識別序列和3個MYB轉(zhuǎn)錄因子核心識別序列。研究表明，鹽分脅迫誘導(dǎo)的OsCDPK6在葉片中的增強表達，可能是