OsMAPK4基因水稻突變體的培育及功能分析.pdf

1、本研究構(gòu)建了由Ubi強啟動予調(diào)控的OsMAPK4基因的RNAi載體pCMI。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCMI及OsMAPK4基因的超量表達載體pCME12導(dǎo)入黑龍江省優(yōu)良水稻品種“五優(yōu)稻一號”。經(jīng)Bialaphos對PCR陽性植株T1代幼苗的篩選及抗性苗的PCR檢測，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的T1代轉(zhuǎn)基因植株。分析了轉(zhuǎn)pCME12T1代水稻植株的耐鹽性。獲得OsMAPK4基因下調(diào)表達的轉(zhuǎn)pCMI植株2個和OsMAPK4基因上調(diào)表達的轉(zhuǎn)pCME12植

2、株2個。Real-timePCR分析了150mMNaCl誘導(dǎo)前后高表達植株、低表達植株與野生型植株中OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄情況。經(jīng)過芯片雜交和表達譜分析，發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)pCME12植株中，上調(diào)表達基因1022個，有GO注釋的116個；轉(zhuǎn)pCMI植株中，下調(diào)表達基因1654個，有GO注釋的260個。其中，有37個為注釋后相同的基因。分析這37個基因的功能與注釋信息，最后篩選出與耐鹽過程密切相關(guān)的基因13個，分為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達調(diào)控和耐

3、鹽功能基因3類。主要研究結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了OsMAPK4基因的RNAi載體pCMI該載體含有長度為143bp的OsMAPK4基因的反向重復(fù)序列和232bp的內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄后反向重復(fù)序列可相互配對，形成發(fā)卡，加工、處理成為小的短鏈RNA分子，啟動OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。 2.獲得了轉(zhuǎn)pCMI和轉(zhuǎn)pME12水稻PCR陽性植株利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻“五優(yōu)稻1號”進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)pCMI抗性植株38株，

4、轉(zhuǎn)pME12抗性植株23株。PCR陽性植株分別為10株、11株，PCR剛性率分別為26.3％、47.8％。收獲PCR剛性植株T1代種子。 3.篩選得到抗Bialaphos且PCR檢測呈陽性的T1代植株經(jīng)含有6mg/LBialaphos的M0培養(yǎng)基對PCR陽性植株T1代幼苗的篩選，得到轉(zhuǎn)pCMI抗性株系5個，轉(zhuǎn)pCME12抗性株系7個。從其中每個抗Bialaphos的株系中隨機選取2個植株進行PCR檢測，分別獲得陽性植株9株和12

5、株。 4.分析了轉(zhuǎn)pCME12T1代水稻植株的耐鹽性在含有0.2mol/L，濃度NaCl的M1培養(yǎng)基上檢測了11株轉(zhuǎn)pCME12PCR陽性植株的T1代種子的耐鹽性，其中3株具有明顯耐受性。說明OsMAPK4基因在種子萌發(fā)期及幼苗生長期增強了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性。 5.檢測了轉(zhuǎn)基因植株中OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平(1)篩選了Real-timePCR檢測引物：β-actin內(nèi)參基因引物及OsMAPK4基因特異引物各1對。(2

6、)對T1代抗Bialaphos植株進行了Real-timePCR.檢測，檢洲的5個轉(zhuǎn)pCMI的植株中，有2個株系OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄水平低于非轉(zhuǎn)基因植株，降低水平分別為未轉(zhuǎn)基因植株的1/7、1/9：檢測的3個轉(zhuǎn)pCME12的植株中，有2個株系OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄水平高于非轉(zhuǎn)基因植株，提高水平分別為術(shù)轉(zhuǎn)基因植株的3.6、2.3倍。 (3)對150mMNaCl誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因植株中OsMAPK4基因的表達水平進行了Real-tim

7、ePCR檢測。在轉(zhuǎn)pCMI的兩個植株中，OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平為未誘導(dǎo)之前的0.41、0.69倍；轉(zhuǎn)pCME12的兩個株系中，OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為未誘導(dǎo)之前的1.23、1.69倍。 6.轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄組分析(1)分析了轉(zhuǎn)OsMAPK4基因水稻突變體在150mMNaCl誘導(dǎo)前后基因表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)pCME12植株中，上調(diào)表達基因1022個，有GO注釋的116個；轉(zhuǎn)pCMI植株中，下調(diào)表達基因165