OsMAPK4基因水稻突變體的培育及功能分析.pdf

1、本研究構(gòu)建了由Ubi強(qiáng)啟動(dòng)予調(diào)控的OsMAPK4基因的RNAi載體pCMI。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCMI及OsMAPK4基因的超量表達(dá)載體pCME12導(dǎo)入黑龍江省優(yōu)良水稻品種“五優(yōu)稻一號(hào)”。經(jīng)Bialaphos對(duì)PCR陽性植株T1代幼苗的篩選及抗性苗的PCR檢測(cè)，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的T1代轉(zhuǎn)基因植株。分析了轉(zhuǎn)pCME12T1代水稻植株的耐鹽性。獲得OsMAPK4基因下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)pCMI植株2個(gè)和OsMAPK4基因上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)pCME12植

2、株2個(gè)。Real-timePCR分析了150mMNaCl誘導(dǎo)前后高表達(dá)植株、低表達(dá)植株與野生型植株中OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄情況。經(jīng)過芯片雜交和表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)pCME12植株中，上調(diào)表達(dá)基因1022個(gè)，有GO注釋的116個(gè)；轉(zhuǎn)pCMI植株中，下調(diào)表達(dá)基因1654個(gè)，有GO注釋的260個(gè)。其中，有37個(gè)為注釋后相同的基因。分析這37個(gè)基因的功能與注釋信息，最后篩選出與耐鹽過程密切相關(guān)的基因13個(gè)，分為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和耐

3、鹽功能基因3類。主要研究結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了OsMAPK4基因的RNAi載體pCMI該載體含有長度為143bp的OsMAPK4基因的反向重復(fù)序列和232bp的內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄后反向重復(fù)序列可相互配對(duì)，形成發(fā)卡，加工、處理成為小的短鏈RNA分子，啟動(dòng)OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。 2.獲得了轉(zhuǎn)pCMI和轉(zhuǎn)pME12水稻PCR陽性植株利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻“五優(yōu)稻1號(hào)”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)pCMI抗性植株38株，

4、轉(zhuǎn)pME12抗性植株23株。PCR陽性植株分別為10株、11株，PCR剛性率分別為26.3％、47.8％。收獲PCR剛性植株T1代種子。 3.篩選得到抗Bialaphos且PCR檢測(cè)呈陽性的T1代植株經(jīng)含有6mg/LBialaphos的M0培養(yǎng)基對(duì)PCR陽性植株T1代幼苗的篩選，得到轉(zhuǎn)pCMI抗性株系5個(gè)，轉(zhuǎn)pCME12抗性株系7個(gè)。從其中每個(gè)抗Bialaphos的株系中隨機(jī)選取2個(gè)植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別獲得陽性植株9株和12

5、株。 4.分析了轉(zhuǎn)pCME12T1代水稻植株的耐鹽性在含有0.2mol/L，濃度NaCl的M1培養(yǎng)基上檢測(cè)了11株轉(zhuǎn)pCME12PCR陽性植株的T1代種子的耐鹽性，其中3株具有明顯耐受性。說明OsMAPK4基因在種子萌發(fā)期及幼苗生長期增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性。 5.檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株中OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平(1)篩選了Real-timePCR檢測(cè)引物：β-actin內(nèi)參基因引物及OsMAPK4基因特異引物各1對(duì)。(2

6、)對(duì)T1代抗Bialaphos植株進(jìn)行了Real-timePCR.檢測(cè)，檢洲的5個(gè)轉(zhuǎn)pCMI的植株中，有2個(gè)株系OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄水平低于非轉(zhuǎn)基因植株，降低水平分別為未轉(zhuǎn)基因植株的1/7、1/9：檢測(cè)的3個(gè)轉(zhuǎn)pCME12的植株中，有2個(gè)株系OsMAPK4基因轉(zhuǎn)錄水平高于非轉(zhuǎn)基因植株，提高水平分別為術(shù)轉(zhuǎn)基因植株的3.6、2.3倍。 (3)對(duì)150mMNaCl誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因植株中OsMAPK4基因的表達(dá)水平進(jìn)行了Real-tim

7、ePCR檢測(cè)。在轉(zhuǎn)pCMI的兩個(gè)植株中，OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平為未誘導(dǎo)之前的0.41、0.69倍；轉(zhuǎn)pCME12的兩個(gè)株系中，OsMAPK4基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為未誘導(dǎo)之前的1.23、1.69倍。 6.轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄組分析(1)分析了轉(zhuǎn)OsMAPK4基因水稻突變體在150mMNaCl誘導(dǎo)前后基因表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)pCME12植株中，上調(diào)表達(dá)基因1022個(gè)，有GO注釋的116個(gè)；轉(zhuǎn)pCMI植株中，下調(diào)表達(dá)基因165