冠脈介入治療對不穩(wěn)定性心絞痛患者內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱為冠心?。–oronary heart disease，CHD），臨床上分為急性冠狀動脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)和慢性心肌缺血綜合征，不穩(wěn)定性心絞痛(Unstable angina，UA)是ACS中的常見類型，它是在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生了冠狀動脈內(nèi)膜下出血，斑塊破裂，破損處血小板與纖維蛋白凝集形成血栓，導(dǎo)致冠狀動脈痙攣以及遠(yuǎn)端小血管栓塞而引起的急性或亞急性

2、心肌缺血所致。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是機(jī)體中存在的，能特異性歸巢于缺血損傷部位，并可進(jìn)一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)的一群前體細(xì)胞。大量研究顯示，EPCs可促進(jìn)血管新生，修復(fù)損傷內(nèi)膜，在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)中起著重要作用，在冠心病的防治上有巨大的潛力。
　　 與正常人比較，冠心病患者外周血EPCs的數(shù)量在不同的病理生理階段出現(xiàn)了不同

3、的變化。在慢性缺血性綜合征患者中，外周血EPCs的數(shù)量降低，這可能與冠心病的多項(xiàng)危險(xiǎn)因素有關(guān);在急性心肌梗死的患者中，外周血EPCs的數(shù)量增加，可能是嚴(yán)重的心肌缺血刺激機(jī)體，通過增加外周血EPCs數(shù)量，發(fā)展新生血管及側(cè)支循環(huán)以維持心臟血流灌注所導(dǎo)致。而不穩(wěn)定性心絞痛患者既存在慢性缺血性綜合征患者的多項(xiàng)危險(xiǎn)因素，又因其冠狀動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定而易導(dǎo)致心肌缺血加重，因此冠狀動脈的病變程度是否與外周血EPCs數(shù)量存在相關(guān)性，目前國內(nèi)外相關(guān)的研究

4、結(jié)果尚有爭議。經(jīng)皮冠脈介入治療(Percutaneous coronaryintervention，PCI)是目前治療冠心病不穩(wěn)定性心絞痛的重要手段，它可以重建穩(wěn)定的冠脈血流，降低心臟功能損害的程度，從而改善預(yù)后及降低病死率，但PCI對EPCs的數(shù)量以及生物學(xué)功能的影響，目前國內(nèi)外相關(guān)的報(bào)道較少。
　　 因此，我們通過對不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs的數(shù)量進(jìn)行檢測，并通過Gensini評分系統(tǒng)對不穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈病變的嚴(yán)重

5、程度進(jìn)行定量評分，然后與上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討它們的相關(guān)性;在此基礎(chǔ)上，我們對符合PCI指征的不穩(wěn)定性心絞痛患者進(jìn)行了介入治療，并觀察PCI術(shù)后1周及6月患者外周血EPCs的數(shù)量，雙陽性細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞遷移能力、增殖能力等指標(biāo)，并與單純藥物治療的患者進(jìn)行比較，進(jìn)一步探討經(jīng)皮冠脈介入治療是否對不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs的數(shù)量及生物學(xué)功能產(chǎn)生有利影響。希望通過我們的研究，為不穩(wěn)定性心絞痛的診斷和治療提供新的思路。
　　

6、目的：
　　 1.通過檢測不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs數(shù)量，結(jié)合Gensini評分系統(tǒng)對冠脈病變進(jìn)行的定量評分，探討冠脈病變的嚴(yán)重程度與外周血EPCs數(shù)量的相關(guān)性;
　　 2.探討經(jīng)皮冠脈介入治療對不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞遷移能力、增殖能力的影響;
　　 3.探討與單純藥物治療比較，經(jīng)皮冠脈介入治療不穩(wěn)定性心絞痛是否更有利于改善患者的外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞遷

7、移能力、增殖能力。
　　 方法：
　　 1.選取2011年1月～2012年6月在我院心血管內(nèi)科住院并經(jīng)冠脈造影確診的，年齡在45-69歲的不穩(wěn)定性心絞痛患者56例為研究對象，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均排除腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、急性腦血管意外、糖尿病等疾病，入院前均未服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)，血管緊

8、張素Ⅱ受體拮抗劑(AngiotensinⅡ receptor blocker, ARB)及羥甲基戊二酸單酰輔酶A（3-Hydroxy-3-methyl glutarul coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑等。
　　 2.冠狀動脈狹窄程度評估采用Judkins法對所有患者行選擇性冠狀動脈造影術(shù)。根據(jù)Gensini評分系統(tǒng)對冠狀動脈狹窄程度進(jìn)行定量分析，評分方法為每段冠狀動脈管腔狹窄的評分乘以各病變血管的權(quán)重系數(shù)，最

9、后總評分為各段評分之和。
　　 3.冠脈造影及術(shù)后處理患者完成造影后分為兩組，介入組30例行介入治療，植入雷帕霉素藥物支架，術(shù)后規(guī)范地按冠心病二級預(yù)防方案治療，服用ACEI/ARB類藥物、HMG-CoA還原酶抑制劑和抗血小板藥物等進(jìn)行治療。藥物組26例術(shù)后規(guī)范地按冠心病二級預(yù)防方案治療。
　　 4.外周血EPCs數(shù)量、生物學(xué)功能的檢測介入組及藥物組在冠脈造影術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后6月隨訪時(shí)完成下列檢測。
　　 4.

10、1流式細(xì)胞儀檢測外周血EPCs數(shù)量使用乙二胺四乙酸(Ethylenedianinetetraacetic acid，EDTA)管抽取2ml靜脈血，取人外周靜脈血100μl置于流式管中;加入藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標(biāo)記的鼠抗人KDR抗體，異硫氰酸熒光素(Flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)標(biāo)記的鼠抗人CD34抗體10μl，陰性對照管加入PE、FITC和

11、別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的同型大鼠IgG抗體10μl;4℃避光孵育30 min;250g離心5min;棄去上清液，流式細(xì)胞檢測緩沖液洗滌2次，4％多聚甲醛溶液重懸，流式細(xì)胞儀檢測分別檢測CD34+/KDR+陽性細(xì)胞(EPCs)。以105單個核細(xì)胞中含有CD34+/KDR+陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其值以千分比表示。
　　 4.2 EPCs培養(yǎng)與鑒定抽取外周血20ml，密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞。貼壁細(xì)胞

12、培養(yǎng)7d后，加入0.02 mg/ml的DiI-acLDL溶液，37℃下孵育2h;用磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)沖洗2次;加入4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15min;用PBS清洗2次;加入0.01 mg/ml的FITC-UEA-1溶液，37℃下孵育1h;加入10μg/ml的4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI

13、)溶液，37℃下孵育5min。熒光倒置顯微鏡觀察，DiI-acLDL（紅色）和FITC-UEA-1（綠色）雙染色陽性細(xì)胞（雙陽性細(xì)胞）為EPCs。EPCs培養(yǎng)第7天后，在40倍顯微鏡下隨機(jī)選3個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，求平均值。
　　 4.3 EPCs遷移能力檢測將含50 ng/mL血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的杜氏(Dulbecco's modified eagle

14、 medium, DMEM)培養(yǎng)液加入改良Boyden小室的下室，用2.5g/L胰酶消化貼壁細(xì)胞，懸浮于DMEM培養(yǎng)液中。將1×105個細(xì)胞懸浮在500μl DMEM培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h后，刮去濾膜上面的未遷移細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa溶液染色，在400倍顯微鏡下隨機(jī)選3個視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，求平均值。
　　 4.4 EPCs增殖能力檢測在EPCs培養(yǎng)了7天之后，先用2.5g/L的胰蛋白酶分離出貼壁細(xì)胞，再將細(xì)胞懸浮于預(yù)

15、先制備好的DMEM培養(yǎng)液中。然后將相同數(shù)量的EPCs接種到人纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板每孔加10μl噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldipheny-tetrazolium bromide，MTT)(5g/L)，經(jīng)過4h的培養(yǎng)后，先去除上清液，然后加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)（150μl/孔），并充分搖勻，10分鐘后在酶標(biāo)儀下在波長490 nm處測吸光度值。
　　 結(jié)果：

16、r>　　 1.介入組與藥物組基線資料比較:兩組基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.不穩(wěn)定性心絞痛患者（所有研究對象）Gensini評分與外周血EPCs數(shù)量，的對比分析:Gensini評分與外周血EPCs數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.713，n=56，P＜0.01）。
　　 3.冠脈造影術(shù)后介入組外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞遷移能力、增殖能力的變化:
　　 3.1術(shù)后1周與術(shù)前比較術(shù)后1周外

17、周血EPCs數(shù)量高于術(shù)前(0.57±0.04‰vs0.30±0.04‰)，雙陽性細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前(67.70±4.09vs39.90±3.94)，細(xì)胞遷移能力高于術(shù)前(34.03±3.43vs22.90±3.68)，增殖能力高于術(shù)前(0.67±0.04vs0.28±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.2術(shù)后6月與術(shù)前比較術(shù)后6月外周血EPCs數(shù)量高于術(shù)前(0.53±0.04‰vs0.30±0.04‰)，雙陽

18、性細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前(53.90±4.13vs39.90±3.94)，細(xì)胞遷移能力高于術(shù)前(30.60±4.00vs22.90±3.68)，增殖能力高于術(shù)前(0.52±0.04vs0.28±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 4.冠脈造影術(shù)后藥物組外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞遷移能力、增殖能力的變化:
　　 4.1術(shù)后1周與術(shù)前比較術(shù)后1周外周血EPCs數(shù)量高于術(shù)前(0.44±0.04‰vs0

19、.30±0.04‰)，雙陽性細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前(48.92±3.55vs37.96±4.38)，細(xì)胞遷移能力高于術(shù)前(27.12±3.91vs24.65±3.84)，增殖能力高于術(shù)前(0.54±0.04vs0.29±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 4.2術(shù)后6月與術(shù)前比較術(shù)后6月外周血EPCs數(shù)量高于術(shù)前(0.45±0.04‰vs0.30±0.04‰)，雙陽性細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前(47.77±4.17vs37.9

20、6±4.38)，細(xì)胞遷移能力高于術(shù)前(27.54±4.24vs24.65±3.84)，增殖能力高于術(shù)前(0.46±0.04vs0.29±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5.冠脈造影術(shù)后介入組和藥物組外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞遷移能力、增殖能力變化的比較
　　 5.1介入組術(shù)后1周外周血EPCs數(shù)量高于藥物組(0.57±0.04‰vs0.44±0.04‰)，雙陽性細(xì)胞數(shù)量高于藥物組（67

21、.70±4.08vs48.92±3.55），遷移能力高于藥物組（34.03±3.43vs27.11±3.91），增殖能力高于藥物組（0.67±0.04vs0.54±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　 5.2介入組術(shù)后6個月外周血EPCs數(shù)量高于藥物(0.53±0.04‰vs0.45±0.04‰)，雙陽性細(xì)胞數(shù)量高于藥物組（53.90±4.13vs47.76±4.17），遷移能力高于藥物組（30.60±4.00v

22、s27.53±4.24），增殖能力高于藥物組（0.52±0.04vs0.46±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs數(shù)量與冠狀動脈病變程度呈正相關(guān);
　　 2.不穩(wěn)定性心絞痛患者藥物治療1周及6月后外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量、遷移及增殖能力增高;
　　 3.不穩(wěn)定性心絞痛患者介入治療1周及6月后外周血EPCs數(shù)量，雙陽性細(xì)胞數(shù)量、遷