軟脂酸三甲基殼聚糖聚合物包載去氫駱駝蓬堿肝腫瘤靶向自組裝膠束研究.pdf

1、目的：以三甲基殼聚糖(Trimethyl-chitosan,TMC)為基礎(chǔ)，合成三種兩親性可發(fā)生自組裝的聚合物分子，包括軟脂酸三甲基殼聚糖1和2(Palmitoyl-trimethyl-chitosan1 and2,TPCS1 and TPCS2)，以及乳糖酸修飾的軟脂酸三甲基殼聚糖(Lac-palmitoyl-trimethyl-chitosan, Lac-TPCS2)，并以其為載體，以難溶性藥物去氫駱駝蓬堿(Harmine，HM)為

2、模型藥物，其疏水性的內(nèi)核可以包載增溶HM制備三種載藥膠束(TPCS1/HM, TPCS2/HM,和Lac-TPCS2/HM)，緩慢釋放HM降低毒副作用同時(shí)結(jié)合載體靶向作用實(shí)現(xiàn)HM在體內(nèi)對(duì)肝臟部位腫瘤的有效遞送，增強(qiáng)HM的抗肝癌療效。
　　方法：(1)通過烷基化反應(yīng)合成三甲基殼聚糖，接著通過縮合法合成TPCS1， TPCS2和Lac-TPCS2。通過紅外光譜、1HNMR表征三種聚合物的結(jié)構(gòu)，測定其臨界膠束濃度(Critical mi

3、cellar concentration，CMC)。以TPCS2為例，采用薄膜分散法制備載去氫駱駝蓬堿的膠束，通過單因素和星點(diǎn)設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化載藥膠束的處方工藝。利用紅外光譜等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表征，并考察不同介質(zhì)中三種載藥膠束的釋放特性。(3)以人源性肝腫瘤細(xì)胞株HepG2為體外細(xì)胞模型，采用MTT法研究膠束的細(xì)胞毒性，并將細(xì)胞攝取過程假設(shè)為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型來研究膠束的攝取及消除過程，同時(shí)采用原子力顯微鏡，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)

4、多種方式探索藥物的攝取過程和作用機(jī)制，定量定性地考察三種膠束對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的親和性，并借助不同抑制劑細(xì)致研究了HepG2細(xì)胞吞噬膠束的途徑。(4)以H22荷瘤小鼠為腫瘤模型動(dòng)物，考察膠束在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性，并初步研究了其安全性。(5)以H22荷瘤裸鼠為腫瘤模型動(dòng)物，Cy7標(biāo)記納米膠束載體Lac-TPCS2，采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)考察其在小鼠體內(nèi)的吸收分布情況。
　　結(jié)果：(1)合成了兩種軟脂酸取代度的TPCS1和TPCS2，以及

5、Lac-TPCS2，其結(jié)構(gòu)得到紅外圖譜和1HNMR譜的表征；測定其臨界膠束濃度約為10-2mg/mL，其中TPCS2臨界膠束濃度略小，是由于軟脂酸取代較高對(duì)形成膠束更為有利。通過單因素試驗(yàn)，星點(diǎn)試驗(yàn)優(yōu)化載藥膠束的制備處方。對(duì)膠束各方面特性進(jìn)行表征:三種膠束的平均粒徑約為200nm，其中TPCS2/HM的包封率為(91.15±0.14)%，載藥量(14.58±0.23)%。電鏡照片顯示膠束外觀圓整，粒徑分布均勻。三種納米膠束釋放行為均體現(xiàn)

6、出顯著的緩釋特性，其中軟脂酸取代較大的TPCS2/HM釋放更為緩慢，且在酸性pH下釋放更為迅速。(2)和原藥HM相比膠束對(duì)肝腫瘤細(xì)胞HepG2更具親和性，細(xì)胞毒作用更顯著。一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合評(píng)價(jià) HepG2細(xì)胞的體外攝取情況：膠束的吸收情況明顯優(yōu)于原料藥HM，且消除時(shí)間也較長。經(jīng)證實(shí)膠束可能是通過網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)，且Lac-TPCS2的內(nèi)吞受到受體介導(dǎo)，可發(fā)生溶酶體逃逸。(3)HM是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑

7、致細(xì)胞死亡的，并可以影響到細(xì)胞周期，膠束具有更好的致細(xì)胞凋亡效果。(4)三種膠束可有效增加HM的抗腫瘤作用，其中乳糖酸修飾的膠束Lac-TPCS2/HM對(duì)比未修飾組TPCS1/HM和TPCS2/HM，有更好的抗腫瘤效果，并可明顯延長小鼠的生存時(shí)間。(5)小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)顯示了Cy7標(biāo)記的Lac-TPCS2/HM較好的肝臟和腫瘤靶向性。
　　結(jié)論：優(yōu)化的載去氫駱駝蓬堿膠束工藝簡單易行，包封率載藥量較高。三種載藥膠束在體外均具有緩釋