脂肪酶構象刻錄及催化能力考察.pdf

1、本文首次闡述了一種新型固定化酶——“刻錄酶”的制備方法。和普通固定化酶相比，首先，它在制備過程中加入了配體誘導酶構象；其次，最終制備得到的刻錄酶構象是剛性化的。文中對刻錄酶的整個制備流程進行了摸索，重點討論了它在水相和有機相中的催化活性、穩(wěn)定性以及在有機相中的吸附配體能力，最后利用SEM對刻錄酶載體進行了宏觀表征。 以聚乙二醇200(400)二(甲基)丙烯酸酯4種不同的功能單體和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為聚合原料，脂肪酶為模板

2、分子，加入配體月桂酸對脂肪酶進行活性構象誘導，再通過紫外光引發(fā)聚合以及無水有機溶劑索式抽提月桂酸后，獲得了4種鎖定脂肪酶活性構象的聚合物，即刻錄脂肪酶聚合物。在以無水丙酮為洗脫劑時獲得了最高86.31％的月桂酸洗脫率，且脂肪酶的洗脫量保持在一個較小范圍。當單體和交聯劑以質量比為2：1，紫外光照聚合時間為45s時，所得四種刻錄酶都表現出了優(yōu)異的抗溶脹穩(wěn)定性，尤其在正庚烷和水中為最佳。這些都基本符合對“刻錄酶”載體性能的預期設想。

3、論文對刻錄酶在水相和有機相的催化特性進行了探索。水相催化采用橄欖油水解法，發(fā)現四種刻錄酶都具有較好的活性和穩(wěn)定性。它們在水相中最佳催化時間為15min，活性最大在Da(聚乙二醇400二丙烯酸酯為單體的刻錄酶)上獲得(6.07U/g)，活性收率高達171％；同時經過比較，發(fā)現含有甲基的單體聚合時容易形成超支化聚合物，增大反應時的傳質阻力，造成其活性和活性收率都大大降低；四種刻錄酶在強酸(pH=2.42)、強堿(pH=12.00)和高溫(8

4、0℃)下均可以分別保持它們初始活性的75％、50％和70％以上，其中Da在160℃左右完全失活，這是因為載體在153℃開始熱不穩(wěn)定造成的；用沉淀變性劑和溶解變性劑分別浸泡刻錄酶30d后，四種刻錄酶仍然可以表現出它們初始活性的50％和45％以上。這說明脂肪酶構象的高度剛性化對它在水相催化時的活性和穩(wěn)定性都是非常有利的。有機相催化選用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反應體系，以活性最大的Da為考察對象，發(fā)現它在有機相催化中活性較為低下。40℃時催

5、化24h活性為15.30U/g，升溫至50℃可以小幅度提升Da活性為16.67U/g，而此時活性僅為固體酶粉的46.88％；但刻錄酶優(yōu)異的穩(wěn)定性在有機相中繼續(xù)得以體現。經過5次連續(xù)的循環(huán)抽提和催化反應后，刻錄酶仍然可以殘留91.04％的初始活性。在進一步研究中顯示，通過加入致孔劑甲苯減少傳質阻力的方法無法提升酶活性，因為甲苯容易使游離酶失活，而直接提高正庚烷中的含水量卻可以大幅度提高酶活性。當正庚烷的水含量為1％(v/v)時刻錄酶活性為

6、最大，40℃時催化24h活性達38.23U/g，是無水時活性的2.49倍。但隨著正庚烷中含水量的繼續(xù)增加，刻錄酶活性不斷下降，至10％(v/v)時完全失活。這說明水引發(fā)的刻錄酶柔性對酶活性提高有至關重要的作用，保持脂肪酶活性構象的同時增加些許柔性可以獲得最為理想的活性效果。40℃在水含量為1％(v/v)的正庚烷酯化體系中，刻錄酶催化的酯化反應過程還基本符合雙底物Ping-Pong理論所描述的反應動力學機制，其動力學方程可表示為ν=20.

7、390[A][B]31.220[B]+1.086[A]+[A][B]。 實驗還對Da的吸附配體能力做了考察。對月桂酸濃度為200μmol/mL的正庚烷溶液進行吸附，發(fā)現Da對配體月桂酸顯示出了一定的吸附能力。在40℃下它的平衡吸附量為30.22(mg·g-1)，較30℃提高1.35倍，吸附收率為70.46％，此時的吸附速率常數為0.024(mg·g-1·min-1)，吸附動力學行為符合Langmuir速率方程；加入致孔劑甲苯可以

8、提高Da的月桂酸吸附量，40℃下平衡吸附量提高為40.04(mg·g-1)，吸附收率達93.35％，此時的吸附速率常數為0.033(mg·g-1·min-1)，且吸附動力學行為也符合Langmuir速率方程。但和有機相催化不一致，水的加入不利于Da的吸附過程，在40℃，當正庚烷中含水量為0.5％(v/v)時，Da的平衡吸附量下降1倍，至5％(v/v)時基本沒有吸附能力。這說明水引發(fā)的刻錄酶柔性改變了它的剛性吸附位點，減弱了吸附作用。