丙型肝炎病毒核心蛋白對基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1表達的影響.pdf

1、目的 肝硬化是丙型肝炎嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，然而丙型肝炎病毒(HCV)引起纖維化、肝硬化的機制尚不清楚，鑒于大量文獻報道HCV核心蛋白在細(xì)胞生長及肝癌發(fā)生方面具有重要調(diào)控作用，我們采用分子生物學(xué)方法研究HCV核心蛋白對TIMP-1基因表達的影響，以探討HCV的致肝纖維化機制。 方法 1.以人基因組DNA為模板，根據(jù)參考文獻設(shè)計引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)，克隆TIMP1p。構(gòu)建TIMP1p的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報告基

2、因表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時平行設(shè)立Pcat3-basic陰性對照組、Pcat3-control陽性對照組，用ELISA法檢測各組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的表達來鑒定TIMP1啟動子的活性。 2.應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將PcDNA3.1(-)-HCVcore與Pcat3-TIMP-1p共轉(zhuǎn)染入LX-2細(xì)胞，同時平行設(shè)立Pcat3-basic陰性對照組、Pcat3-control陽性對照組、Pcat3-TIMP-1p單獨轉(zhuǎn)染組

3、，用ELISA法檢測各組CAT的表達來鑒定HCV核心蛋白對TIMP1表達的影響。 結(jié)果 1.成功克隆TIMP1啟動子片斷，經(jīng)測序鑒定正確。成功構(gòu)建了TIMP1p的CAT報告基因表達載體，Pcat3-TIMP-1p轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，ELISA法檢測結(jié)果顯示Pcat3-basic的吸光度值為0.004±0.002，Pcat3-TIMP-1p為2.329±0.685，經(jīng)方差分析各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=26.075(P＜0

4、.05)，LSD法兩兩比較均顯示P＜0.05，證明TIMP-1p能夠啟動CAT的表達。 2.PcDNA3.1(-)-HCVcore與Pcat3-TIMP-1p共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后，ELISA法檢測結(jié)果顯示Pcat3-TIMP-1p吸光度值為0.833±0.040，同期單獨轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞的Pcat3-TIMP-1p吸光度值為0.677±0.049，方差分析各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=132.401(P＜0.05)，LSD法兩兩比較