基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1基因的RNAi載體構(gòu)建及其抑制效應(yīng).pdf

1、肝纖維化是所有慢性肝病的共同病理改變過程,其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的合成增多、降解減少,導(dǎo)致其在肝內(nèi)過度沉積。在ECM降解過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)發(fā)揮了重要的作用,但MMPs的活性可被機(jī)體自身產(chǎn)生的內(nèi)源性抑制物——基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinas,TIMPs)所抑制,后者共有4

2、個(gè)亞型,而以TIMP-1的作用最為顯著。研究表明,肝纖維化過程是可以逆轉(zhuǎn)的,在阻止肝纖維化形成中,一方面需積極抑制膠原過度產(chǎn)生,另一方面應(yīng)設(shè)法增強(qiáng)能降解ECM的MMPs的活性?；诖死碚?依據(jù)先進(jìn)的RNAi技術(shù),我們設(shè)想通過沉默TIMP-1基因,解除其對MMPs的抑制效應(yīng),實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生。本課題構(gòu)建介導(dǎo)TIMP-1基因的RNAi慢病毒載體,以肝星狀細(xì)胞-T6(hepaticstellatecells-T6,HSC-T6)為研究靶

3、細(xì)胞,體外證明了TIMP-1基因沉默的效果,為抗肝纖維化的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。
　　主要的研究內(nèi)容及方法
　　1.針對TIMP-1基因的RNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定
　　從GeneBank獲得TIMP-1編碼區(qū)的基因序列,遵循篩選RNAi靶基因的一般規(guī)則,確定四條19nt的靶序列,分別合成一對互補(bǔ)的寡核苷酸序列,退火后形成雙鏈DNA片段。同時(shí),利用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP載體使其線性化。隨之將兩者

4、連接,取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,并對長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定,再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序、比對分析,比對正確的即為構(gòu)建成功的TIMP-1的RNA干擾慢病毒載體(pGCSIL-GFP-shRNA)。
　　利用PCR方法從含有TIMP-1目的基因的質(zhì)粒中,釣取TIMP-1的基因片段,并將其進(jìn)行擴(kuò)增、酶切。同時(shí),對pEGFP-N1-3FLAG載體也進(jìn)行酶切、純化。然后將兩者定向克隆連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,并對長出的克

5、隆進(jìn)行PCR鑒定,再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序、比對分析,比對正確的即為克隆成功的含TIMP-1靶序列的重組質(zhì)粒(pEGFP-N1-3FLAG-TIMP-1)。
　　將重組pEGFP-N1-3FLAG-TIMP-1質(zhì)粒分別與四個(gè)不同干擾靶點(diǎn)的慢病毒質(zhì)粒pGCSIL-GFP-shRNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h收集細(xì)胞,抽提蛋白,利用WesternBlot測定,進(jìn)而篩選出對目的基因TIMP-1有敲減作用的有效靶點(diǎn)。
　

6、　2.TIMP-1基因的RNAi載體在大鼠HSC-T6細(xì)胞中抑制效應(yīng)
　　通過Real-timePCR和WesternBlot檢測,在HSC-T6細(xì)胞中,進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的含有有效靶點(diǎn)慢病毒載體pGCSIL-GFP-shRNA對TIMP-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制效果。
　　主要結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了TIMP-1基因的RNAi的慢病毒載體。
　　2.篩選出一段有效的干擾靶點(diǎn),即位于TIMP-1基因的173~192n