異丙酚對人血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響與機制探討.pdf

1、本研究擬觀察臨床相關(guān)濃度的異丙酚(propofol，PF)預(yù)處理對缺氧復(fù)氧損傷人VEC凋亡的影響以及細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子如核因子κB(NF-κB)、誘生型氮氧合酶(iNOS)、蛋白激酶C(PKC)等的表達(dá)變化，探討其對IRI的作用及相關(guān)細(xì)胞調(diào)節(jié)機制，為圍術(shù)期組織器官功能保護(hù)提供新的理論依據(jù)。 實驗材料： 1、實驗試劑： 異丙酚(阿斯利康，英國)；Bd-2兔抗人多克隆抗體(即用型)(Santa，美國)；caspase-3

2、、PKC-Epsilon兔抗人多克隆抗體(Neomarker，美國)；Histostain<'TM>plus kits SP 9000免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB染色試劑盒、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉生物公司)；胰蛋白酶(1：250)(Amresco，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；極品胎牛血清(天津灝洋生物)；FITC-Annexin V(寶靈曼，德國)；Furo-2、碘化丙啶(Sigma,美國)；Trizol(Inv

3、itro-gen，美國)；One step RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；PVDF蛋白印跡膜(Bio-Rad，美國)；VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，本校實驗病理研究室自制)；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。 2、實驗儀器： 振蕩水浴箱(GFL THERMOLAB，美國)超低溫冰箱(SANYO MDF-U，日本)旋渦振蕩器(VORTEX-2 GENE，美國)水平板電泳系統(tǒng)(BIO-RAD Sub-cell GT

4、，美國)通用電泳儀(BIO-BAD PowerPac200，美國)臺式低溫高速冷凍離心機(Sigma 3K30，美國)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(KENDRO/HERAEUS，德國)細(xì)胞培養(yǎng)專用超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)倒置顯微鏡(OLYMPUS AX70，日本)水平搖床(GFL，美國)顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph，日本)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(余姚TDW，中國)自動電泳凝膠

5、成像分析儀(Alphainnotech Chemilmager 5500，美國)小型垂直電泳儀(Bio-Rad Mini-Protein，美國)半干轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad．Seimidry transfer system，美國)FACS CMibur流式細(xì)胞儀(BD，美國)自動封膜儀(江蘇儀器設(shè)備公司，中國)HEIDOLPH DIAXg00型勻漿機(德國)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(USA)GLS-700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)(上海

6、，中國)A-200 Ds電子天平(美國)B-Brown微量泵(德國)超純水裝置(MITJJPORE MILLI-Q，美國)實驗室制冰機(zIGERA 2BE-70-35，德國)恒溫振蕩培養(yǎng)箱(GFL，德國)小型臺式離心機(SIGMA 1-13，美國)PH計(WTW InoLab，德國)電動高壓消毒鍋(HIRAYAMA HVE-50，美國)HSS-1數(shù)字超級恒溫浴槽(成都儀器廠，中國)倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、

7、培養(yǎng)瓶、離心管等(Coming，美國)。 實驗方法： 1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)。0.125％胰蛋白酶消化法分離內(nèi)皮細(xì)胞，用含20％胎牛血清、100μg/mlVEGF、50U/ml肝素的DMEM培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％CO<,2>95％空氣的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合單層時，以細(xì)胞數(shù)為1×10<'5>/ml傳代培養(yǎng)，選取第3～4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。培養(yǎng)細(xì)胞采用免疫熒光化學(xué)方法檢測人Ⅷ因子相關(guān)抗

8、原呈陽性，鑒定為人血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2、缺氧復(fù)氧模型的建立。 細(xì)胞培養(yǎng)至融合狀態(tài)，用99.9％高純氮氣飽和15min的低糖DMEM培養(yǎng)液換液，然后將細(xì)胞置于密閉良好的缺氧復(fù)氧特殊裝置中，充人高純氮氣置換裝置內(nèi)空氣造成缺氧。氣體通過濾過裝置流速為5L/min，5min后關(guān)閉進(jìn)出氣閥門，放人5％CO<,2>培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)30min。復(fù)氧時迅速打開裝置，用含20％胎牛血清的含糖DMEM營養(yǎng)液換液后置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，實現(xiàn)VE

9、C缺氧復(fù)氧損傷，各組按設(shè)計分別于復(fù)氧2h、6h、24h和48h后將一部分爬片細(xì)胞以冷丙酮固定備用，另一部分細(xì)胞消化離心后，液氮冷凍，一70℃保存?zhèn)溆谩?3、實驗分組。 細(xì)胞培養(yǎng)至融合狀態(tài)，隨機分為3組。正常對照組(C組)、缺氧復(fù)氧組(HR組)和缺氧復(fù)氧+異丙酚組(PR組)，HR組依復(fù)氧時間不同(2、6、24、48h)又分為4個亞組(HR2、HR6、HR24、HR48組)，PR組按PF濃度不同(25、50、100μmlol

10、/L)分為12個亞組。PR組于缺氧前30min加入含不同濃度PF(25、50、100μmol/L)的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，再進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。 4、檢測指標(biāo)。 (1)流式細(xì)胞儀FITC-AnnexinV/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡(2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)(3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測iNOS及NF-kappaB mR-NA表達(dá)(4)免

11、疫蛋白印跡雜交(Western-blot)檢測PKC蛋白表達(dá)(5)Fura-2/AM熒光標(biāo)記測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度5、圖像分析免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖片，在光學(xué)顯微鏡Olympus AX70下觀察，從每組中選取8-10張切片，每張切片隨機選取5～7個視野，通過MetaMorph4. 5、圖像分析。軟件自動測定每個視野陽性細(xì)胞的光密度(Optical density，OD)，并計算其平均值。Western Blot和RT-PCR測定電泳條

12、帶密度值，在自動電泳凝膠成像分析儀上分析結(jié)果。流式細(xì)胞儀檢測采用CellQUEST分析軟件分析結(jié)果。 6、統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗，P<0.05差異具有顯著性。 研究結(jié)果： 1、PF對缺氧復(fù)氧損傷VEC凋亡的影響隨著缺氧復(fù)氧時間延長，細(xì)胞損傷加重，凋亡數(shù)量增多，至24h達(dá)高峰。

13、不同濃度異丙酚預(yù)適應(yīng)明顯減輕缺氧復(fù)氧引起的細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞凋亡；50、100μmol/L PR組形態(tài)改變更小，凋亡細(xì)胞明顯減少，與相應(yīng)的HR組比較有顯著性差異(P<0.01)。 2、PF對缺氧復(fù)氧損傷VEC Bcl-2蛋白表達(dá)的影響C組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)較低，缺氧復(fù)氧處理后，Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，復(fù)氧24h達(dá)低谷，48h部分恢復(fù)。PF對缺氧復(fù)氧損傷VEC Bd-2蛋白表達(dá)的影響呈劑量依賴關(guān)系，25μmol/L PR，組B

14、cl-2蛋白表達(dá)與相應(yīng)的HR組比較有顯著差異(P<0.01)；50、100μmol/L PR組與相應(yīng)HR組比較差異顯著(P<0.01)，且與25μmol/L PR組比較有顯著差異(P<0.05)。 3、PF對缺氧復(fù)氧損傷VEC causpause-3蛋白表達(dá)的影響正常培養(yǎng)的VEC caspas-3蛋白表達(dá)較低，復(fù)氧2h后caspase-3表達(dá)輕度增強，6h達(dá)較高水平，24h處于高峰，48h有所下降。PF對缺氧復(fù)氧損傷VEC ca

15、uspase-3蛋白表達(dá)的影響呈劑量依賴關(guān)系，25μmol/LPR組caspase-3蛋白表達(dá)與相應(yīng)的HR組比較有顯著差異(P<0.01)；50、100μmol/L PR組與相應(yīng)的HR組比較差異顯著(P<0.01)，且與25μmol/l．PR組比較有顯著差異(P<0.05)。 4、PF對缺氧復(fù)氧損傷人‘VEC細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響缺氧復(fù)氧損傷可引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯升高，PF(25、50、100μmol/L)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載，各

16、亞組與相應(yīng)的HR組比較差異顯著(P<0．01)。 5、PF對缺氧復(fù)氧損傷人VEC內(nèi)PKC表達(dá)的影響缺氧復(fù)氧使細(xì)胞內(nèi)PKC蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；PF活化PKC蛋白表達(dá)，顯著抑制由缺氧復(fù)氧引起的PKC表達(dá)下調(diào)，與HR組比較差異顯著(P<0.01)。 6、PF對缺氧復(fù)氧損傷人VEC的iNOSmRNA表達(dá)的影響C組iNOS表達(dá)較低，缺氧復(fù)氧使iNOSmRNA表達(dá)明顯升高；PF抑制iNOS mRNA活化，顯著降低其表達(dá)，但

17、未達(dá)正常水平。 7、PF對缺氧復(fù)氧損傷人VEC的NF-kappaB表達(dá)的影響缺氧復(fù)氧激活NF-kappaB使其mRNA含量明顯升高；PF預(yù)處理抑制NF-kappaB表達(dá)，與相應(yīng)HR組比較差異顯著(P<0.01)． 研究結(jié)論： 1、缺氧復(fù)氧損傷使促凋亡因子caspase-3表達(dá)升高，凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)降低，導(dǎo)致VEC凋亡，二者變化與缺氧復(fù)氧損傷存在一定時相關(guān)系。 2、PF預(yù)處理以劑量依賴方式抑制缺氧