利拉魯肽減輕心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的:微血管是心臟終末循環(huán)的末梢，決定了組織灌注水平和氧供平衡。心梗缺血后的再灌注時(shí)期產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是誘導(dǎo)冠脈末梢的CMEC(Cardiac Microvascular Endothelial Cells，CMEC)凋亡的主要因素之一。前期研究證實(shí)，黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)是CMEC在氧化應(yīng)激條件下產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源之一。如何減少CMEC的氧化應(yīng)

2、激損傷是防治急性心肌梗死再灌注損傷的重點(diǎn)。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)近期被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中具有抗氧化應(yīng)激的作用。故本研究旨在探究GLP-1類似物利拉魯肽(GLP-1 Analogue，Liraglutide)對(duì)CMEC生物學(xué)特性的影響，以及缺氧復(fù)氧模型(Hypoxia/Reoxygenation Model，H/R)條件下，Liraglutide保護(hù)CMEC免受氧化應(yīng)激損傷的具體機(jī)制，

3、以及提高CMEC的存活能力的分子信號(hào)通路的研究。
　　方法:雙酶消化法體外分離培養(yǎng)SD大鼠CMEC，差速貼壁法進(jìn)行純化，CD31和Ⅷ因子抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定CMEC純度，CD31和GLP-1R抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)共染細(xì)胞。采用不同濃度Liraglutide(0～100 nM)預(yù)干預(yù)后MTT繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，BrdU熒光標(biāo)記法和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察藥物作用下細(xì)胞增殖和遷移能力。建立H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞

4、凋亡率，DCFHDA熒光探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS的變化，F(xiàn)ura-3 AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，免疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)XO、caspase3等蛋白分子的表達(dá)情況，利用通路阻斷劑和干擾RNA技術(shù)，闡明Liraglutide通過(guò)激活PI3K/Akt-Survivin分子信號(hào)在抗細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中的保護(hù)作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.體外分離SD乳鼠原代CMEC，72h后細(xì)胞呈典型“鋪路石樣”生長(zhǎng)，CD31及

5、Ⅷ因子免疫熒光染色提示雙陽(yáng)性率大于95％，說(shuō)明CMEC純度較高。
　　2.CD31和GLP-1R抗體免疫熒光共定位染色提示CMEC表達(dá)GLP-1受體，MTT示Liraglutide以濃度依賴方式促進(jìn)CMEC的體外增殖，100 nM為其最適生長(zhǎng)濃度。
　　3.予以Liraglutide預(yù)處理細(xì)胞24 h，BrdU和劃痕實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明Liraglutide能以濃度依賴性促進(jìn)CMEC的增殖和遷移能力。
　　4.通過(guò)缺氧4h復(fù)氧4

6、h成功建立H/R模型，在該模型條件下可以顯著提高胞漿ROS含量、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而Liraglutide預(yù)處理細(xì)胞12h可以通過(guò)降低ROS、進(jìn)而減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。
　　5.H/R模型誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)表達(dá)增加，生成過(guò)量ROS及增加凋亡蛋白的表達(dá)。利用siRNA敲低XO或予以Liraglutide預(yù)處理可顯著降低胞漿ROS水平，同時(shí)降低凋亡蛋白的表達(dá)。
　　6.H/R模型條件導(dǎo)致細(xì)胞胞漿鈣

7、超載，誘導(dǎo)XO表達(dá)增加，生成過(guò)量ROS及凋亡蛋白的表達(dá)。使用BAPTA中和鈣離子或Liraglutide預(yù)處理12 h可明顯減少XO表達(dá)，降低胞漿ROS水平，同時(shí)降低凋亡蛋白的表達(dá)。
　　7.H/R模型誘導(dǎo)過(guò)量胞漿XO-ROS生成，最終導(dǎo)致了線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素c向胞漿滲漏，線粒體凋亡通路的激活。Liraglutide預(yù)處理12h或敲低XO可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的丟失和細(xì)胞色素c向胞漿的滲漏，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。

8、r>　　8.H/R模型通過(guò)下調(diào)SERCA2a、促進(jìn)IP3R轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道失衡、誘導(dǎo)胞漿鈣超載，從而升高XO的表達(dá)以及胞漿ROS的含量。阻斷IP3R、鰲合胞漿鈣、使用siRNA敲低XO，可以有效降低胞漿ROS水平，同時(shí)降低caspase3的表達(dá);Liraglutide預(yù)處理12 h恢復(fù)SERCA2a的轉(zhuǎn)錄水平并下調(diào)IP3R的轉(zhuǎn)錄，抑制了H/R誘導(dǎo)的鈣失衡、XO的激活，最終降低胞漿過(guò)量ROS并提高細(xì)胞存活。
　　9.Lirag

9、lutide預(yù)處理12 h，CMEC中p-Akt及survivin表達(dá)量升高，給與PI3K/Akt阻斷劑LY294002后，survivin的表達(dá)下降。
　　10.H/R模型中分別阻斷PI3K/Akt、敲低survivin或阻斷GLP-1R，均可以降低Liraglutide對(duì)SERCA2a和IP3R轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，誘發(fā)了下游鈣離子失衡、過(guò)量ROS生成，及凋亡蛋白表達(dá)增加。
　　11.Liraglutide通過(guò)提高SOD、GS

10、H和GPx的含量，維持胞內(nèi)正常ROS水平。
　　結(jié)論:
　　1.Liraglutide是以濃度依賴方式通過(guò)激活胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK/ERK通路促進(jìn)原代大鼠CMEC的增殖和遷移。
　　2.H/R模型通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣超載誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致?lián)p傷軸SR-Ca2+-XO-ROS激活，生成過(guò)量胞漿ROS，最終介導(dǎo)了CMEC的線粒體凋亡通路激活，而予以Liraglutide預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程。
　　3.