牛手工體細(xì)胞克隆技術(shù)的研究.pdf

1、本研究以荷斯坦高產(chǎn)奶牛的顆粒細(xì)胞、耳緣成纖維細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞為供核細(xì)胞，對牛的無透明帶卵母細(xì)胞體細(xì)胞核移植的影響因素進(jìn)行了探討，優(yōu)化了牛的無透明帶卵母細(xì)胞核移植技術(shù)方案，為進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因牛和分離牛的胚胎干細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1.手工去核后無透明帶重構(gòu)胚的細(xì)胞總數(shù)顯著少于顯微擠壓去核方法(124.40vs194.0)(P<0.05)。 2.去核后兩個(gè)半卵粘合交流電壓降低能顯著提高其隨后的融合率，

2、在交流電壓為3V時(shí)，卵母細(xì)胞融合率顯著高于其它兩組(55.51％vs72.17％vs93.83％)(P<0.05)。 3.A23187+6-DMAP激活方法得到的無透明帶重構(gòu)胚分裂率和囊胚率顯著高于Ionomycin+6-DMAP激活法(88.7％vs43.6％，37.4％vs19.9％)(P<0.05)。 4.融合到激活的間隔時(shí)間分別選擇1h、2h和3h，分裂率和囊胚率之間沒有顯著差異(88.05％vs78.79％vs

3、76.62％，31.45％vs43.29％vs32.95％)(P>0.05)。 5.無透明帶重構(gòu)胚在mCR1aa與CR1aa中的分裂率顯著高于SOFaaci(83.17％和65.56％vs37.85％)(P<0.05)。 6.真空蠕動(dòng)泵抽吸法和切割法得到的COCs總數(shù)顯著高于注射器抽吸得到的COCs的總數(shù)(360和361vs219)，且切割法得到的1～2級COCs的數(shù)量顯著高于另外兩種方法(233vs86和208)(P<

4、0.05)。 7.采用不同代數(shù)的耳緣成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植，第6代和第10代的成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植得到的分裂率顯著高于第17代(80.26％和93.1％vs33.96％)(P<0.05)。 8.分別取高產(chǎn)奶牛的耳緣成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的第6代作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，所得的胚胎分裂率及囊胚率均無顯著差異(89.12％vs80.26％,vs79.12％，33.65％vs25.77％vs21.19％)(P>0.0