魯西黃牛體細胞克隆保種技術的研究.pdf

1、該試驗以家畜活體保種規(guī)劃為基礎,魯西黃牛為試驗材料,利用組織塊培養(yǎng)法,首次建立了魯西黃牛耳皮膚上皮細胞和成纖維細胞系,從屠宰場收集卵巢,回收卵丘卵母細胞復合體,培養(yǎng)成熟后的卵母細胞作為核受體,以第六代成纖維細胞作核供體進行核移植,研究了體細胞克隆技術在家畜遺傳資源保護中的應用,并獲得如下結果:1.通過組織塊培養(yǎng)法,獲得了傳代培養(yǎng)的魯西黃牛耳皮膚成纖維細胞和上皮細胞.魯西黃牛皮膚細胞在體外培養(yǎng)時呈貼壁生長,原代與早期傳代細胞是上皮細胞與成

2、纖維細胞的混合物;2.傳代培養(yǎng)混合生長的細胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化處理2~3 min,脫壁懸浮的主要為成纖維細胞,采用反復消化法在傳代過程中將二者逐步分離純化,獲得了可正常傳代的魯西黃牛耳上皮細胞系和成纖維細胞系,表明采用反復消化法可以分離純化上皮細胞和成纖維細胞;3.通過繪制生長曲線研究了魯西黃牛耳皮膚成纖維細胞的增殖規(guī)律,用高糖DMEM培養(yǎng)第四代魯西黃牛皮膚成纖維細胞,傳代后滯留期較短,約有1 d左右,活細胞逐漸貼壁生長

3、.此后進入對數(shù)生長期,延續(xù)6 d左右.第八天細胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡,細胞數(shù)量進入平臺期,維持3 d左右,細胞逐漸脫落死亡,細胞數(shù)有所下降;4.染色體檢查表明,魯西黃牛耳皮膚成纖維細胞在適宜的培養(yǎng)體系,至少可以傳代至12代并保持染色體倍性正常;5.細胞冷凍試驗中,以甘油與DMSO為冷凍保護劑,添加10%血清的DMEM為基礎液,同濃度DMSO作為冷凍液的防凍成分效果優(yōu)于同濃度甘油(p<0.05);DMSO與甘油濃度一定時,血清濃度越高冷

4、凍效果越好(p<0.05);6.從冷凍魯西黃牛耳皮膚組織中成功培養(yǎng)出細胞,證明從冷凍保存的組織中進行細胞的分離培養(yǎng)是可行的.冷凍組織培養(yǎng)出的細胞核型正常,與新鮮組織培養(yǎng)的細胞相同,可以用作細胞生物學及其它相關試驗研究的材料;7.進行體細胞克隆時,采用血清饑餓法與生長抑制法處理供體細胞,結果分裂率有差異(p<0.05),但囊胚率無差異(p>0.05),說明兩者均可用于供體細胞的處理;8.用胚胎細胞差異染色法,對第七天的克隆重構胚進行細胞記