銀鯧腸道菌群結(jié)構(gòu)分析及潛在有益菌的篩選.pdf

1、益生菌通常是一種或多種活的微生物，足夠數(shù)量的益生菌對(duì)宿主本身是有益的。如今，益生菌被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，成為其提高產(chǎn)量的重要手段之一。益生菌在魚類營養(yǎng)，抗病性，免疫調(diào)節(jié)及其他有益方面已被證實(shí)。
　　本研究首先對(duì)野生和養(yǎng)殖銀鯧(Pampus argenteus)胃、幽門盲囊、前腸、中腸、后腸菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定性對(duì)比分析，并對(duì)產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶的菌株進(jìn)行了鑒定。本實(shí)驗(yàn)所用養(yǎng)殖銀鯧來自東海水產(chǎn)研究所自行繁育的后代，野生銀

2、鯧捕自浙江六橫島附近海域。養(yǎng)殖銀鯧的平均叉長為10.5±0.5cm，平均體重為30±5g。野生銀鯧的平均叉長為18.0±0.5cm，平均體重為45±5g。養(yǎng)殖銀鯧在取樣解剖前饑餓24h，野生銀鯧暫養(yǎng)24h，暫養(yǎng)用水取自其生存海域。從2個(gè)水體中隨機(jī)各撈取15尾魚，每3尾分為一組，解剖前進(jìn)行拍照并測(cè)量其叉長和體重。魚體解剖在冰盤上進(jìn)行，取整個(gè)腸道并用70％的酒精擦拭整個(gè)腸外壁，將其分為胃、幽門盲囊、前腸、中腸、后腸分裝于無菌離心管內(nèi)，將每組

3、魚的各消化腸段混合后-80℃凍存。腸道菌群經(jīng)培養(yǎng)后，挑選不同顏色、不同大小、不同形狀的菌株進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，純化的菌株經(jīng)16S rDNA基因序列分析,然后對(duì)其產(chǎn)酶情況進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生和養(yǎng)殖種群的消化道菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異，且同一種群消化道各部分之間菌群結(jié)構(gòu)也存在較大差異。盡管養(yǎng)殖和野生銀鯧均在幽門盲囊中具有最多的可培養(yǎng)細(xì)菌菌株，但野生銀鯧消化道內(nèi)主要菌群為嗜冷菌屬（Psychrobacter）和Pseudochrobactrum

4、，養(yǎng)殖銀鯧消化道主要菌群為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和假單孢菌屬(Pseudomonas)，兩種群共有細(xì)菌僅一株，即Psychrobacter piscatorii strain VSD503，但其分別存在于野生與養(yǎng)殖種群銀鯧消化道的不同部位。在產(chǎn)酶菌株篩選中發(fā)現(xiàn)，野生銀鯧消化道內(nèi)分離到16株產(chǎn)酶菌，其中44%可培養(yǎng)菌能產(chǎn)蛋白酶，56%能產(chǎn)淀粉酶，11%能產(chǎn)脂肪酶，56%能產(chǎn)纖維素酶，部分菌株可產(chǎn)2株以上的消化酶，其中產(chǎn)三

5、種酶以上的菌株有5株，且產(chǎn)酶量豐富。相對(duì)于野生銀鯧，養(yǎng)殖銀鯧消化道內(nèi)分離到22株產(chǎn)酶菌，主要以產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶為主，70%可培養(yǎng)菌可產(chǎn)蛋白酶，21%可產(chǎn)淀粉酶，僅Bacillus thuringiensis strainVITGS可產(chǎn)纖維素酶，無一株菌產(chǎn)脂肪酶，其中只有Bacillus thuringiensis strainVITGS產(chǎn)三種酶但產(chǎn)酶量相對(duì)較少。上述研究結(jié)果可為后續(xù)銀鯧人工養(yǎng)殖中潛在益生菌的篩選提供理論依據(jù)。
　　

6、其次采用酶學(xué)分析法研究了單因子（溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間）變化對(duì)野生銀鯧(Pampus argenteus)消化道內(nèi)同時(shí)分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶中兩種以上的菌株產(chǎn)酶活力的影響。在發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響實(shí)驗(yàn)中，設(shè)25℃、28℃、31℃、34℃、37℃和40℃六個(gè)溫度梯度；在pH對(duì)產(chǎn)酶活力的影響實(shí)驗(yàn)中，設(shè)pH5、6、7、8和9;在發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響實(shí)驗(yàn)中，設(shè)發(fā)酵時(shí)間為1d、2d、3d、4d和5d。將產(chǎn)酶菌按設(shè)定的條件進(jìn)行培養(yǎng)

7、。結(jié)果表明，5株產(chǎn)酶菌在溫度31~37℃、pH7～8、發(fā)酵時(shí)間3d的條件下蛋白酶活力最大；在不同溫度和pH條件下5菌株分泌的淀粉酶活力各不相同，但都隨發(fā)酵時(shí)間的延長而酶活力增大，3～5d達(dá)最大值；分泌纖維素酶的4菌株其纖維素酶活力受環(huán)境影響總體變化不大，酶活力也最低，發(fā)酵溫度31～37℃、酸性條件（pH=5）和發(fā)酵時(shí)間4d的條件下為最大；2株分泌脂肪酶的菌株在28～31℃、中性（pH=7）、發(fā)酵時(shí)間1d條件下其脂肪酶活力最大，最大可接近