寡果糖對(duì)人源菌群仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)和宿主代謝的影響.pdf

1、人的胃腸道中定植著一個(gè)非常復(fù)雜的微生物菌群，其結(jié)構(gòu)和功能與宿主的健康和疾病有非常密切的關(guān)系。益生元是一類人不能消化的食物成分，通過被大腸中的細(xì)菌發(fā)酵，調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝，改善宿主健康。寡果糖是一種被普遍應(yīng)用的益生元，很多研究表明它可以促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，但還沒有研究在系統(tǒng)水平上調(diào)查寡果糖對(duì)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝、以及宿主代謝的影響。若直接以人為對(duì)象進(jìn)行研究，存在很多不便，如難以標(biāo)準(zhǔn)化受試者的飲食、采樣困難以及倫理問題；很多研究采用人

2、源菌群(Human Flora-associated，HFA)大鼠/小鼠為模型，并取得大量成果，但嚙齒類動(dòng)物消化道的解剖和生理特征與人的顯著不同，所得結(jié)果有較大的局限性。而豬的消化系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)與人的相似性很高，更適合構(gòu)建人腸道菌群的動(dòng)物模型。因此，本實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中建立了HFA仔豬模型，證明人的腸道菌群可以在原本無菌的仔豬腸道內(nèi)定植。本論文以HFA仔豬為模型，用分子生態(tài)學(xué)的方法研究寡果糖對(duì)腸道菌群的組成的影響，并用基于核磁共振(N

3、MR)的代謝組學(xué)方法調(diào)查寡果糖對(duì)腸道菌群代謝和宿主代謝的影響。
　　 首先我們建立了針對(duì)人腸道菌群中最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌種群之一——柔嫩梭菌類群的類群特異性PCR-DGGE和克隆文庫的方法。利用一對(duì)柔嫩梭菌類群特異性引物擴(kuò)增得到239 bp的16S rRNA基因片段可以被DGGE很好地分離。11個(gè)健康人的糞便柔嫩梭菌類群DGGE圖譜表明此類群的細(xì)菌組成具有宿主特異性；用DGGE對(duì)一個(gè)兒童的糞便柔嫩梭菌類群進(jìn)行3年的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)在前兩年

4、間有波動(dòng)，而在第三年保持穩(wěn)定。以一個(gè)成人的糞便總DNA為模板，用一個(gè)細(xì)菌通用的上游引物和一個(gè)柔嫩梭菌類群特異性的下游引物擴(kuò)增1143 bp的16S rRNA基因片段，并克隆建庫，挑取100個(gè)克隆。序列分析表明100個(gè)克隆均屬于柔嫩梭菌類群；其中64％的克隆來自Faecalibacteriumprausnitzii，6％來自Subdoligranulum variabile，2％是產(chǎn)丁酸細(xì)菌A2-207，28％來自未知菌種。通過對(duì)比克隆的

5、239 bp片段在DGGE中的遷移位置和DGGE圖譜中條帶的位置，圖譜中絕大多數(shù)條帶的序列得到確定。結(jié)果表明柔嫩梭菌類群特異性DGGE和克隆文庫是分析監(jiān)測(cè)人腸道菌群中柔嫩梭菌類群的有效方法。
　　 為研究寡果糖對(duì)人源腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，我們采集一27歲的健康男性的新鮮糞便樣品制備菌懸液，接種到剖腹產(chǎn)的無菌的仔豬的腸道中，構(gòu)建了HFA仔豬。10只初生的HFA仔豬被平均分到對(duì)照組和益生元組，對(duì)照組仔豬食用基本食譜，益生元組仔豬在基本

6、食譜的基礎(chǔ)上每天飼喂一定量的寡果糖，如此持續(xù)至37日齡。在12日齡、17日齡、25日齡和37日齡收集每只仔豬的糞便樣品，并提取糞便總DNA，分別用類群特異性PCR-DGGE和實(shí)時(shí)定量PCR方法在不同時(shí)間點(diǎn)比較兩組仔豬的擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和柔嫩梭菌類群的組成和數(shù)量。在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒有觀察到寡果糖對(duì)雙歧桿菌的促進(jìn)作用，這可能是由于本研究中的HFA仔豬腸道中的雙歧桿菌豐度較高，益生元不容易對(duì)它們的數(shù)量產(chǎn)生顯著的提高作用。但寡果糖主要影響了其

7、他細(xì)菌：在12日齡，兩種未知擬桿菌的水平被提高；25日齡，寡果糖提高了Subdoligranulum variabile的水平，抑制了屬于柔嫩梭菌類群的一種未知細(xì)菌；37日齡，擬桿菌屬的數(shù)量被寡果糖顯著降低。此工作表明，寡果糖可以影響雙歧桿菌之外的腸道細(xì)菌。我們發(fā)現(xiàn)寡果糖可以刺激S.variabile的生長(zhǎng)，已經(jīng)有研究證明此細(xì)菌具有重要的生理功能，所以在今后的工作中有必要將它分離出來并進(jìn)行功能分析，研究它與益生元和人體健康之間的關(guān)系。<

8、br>　　 接著，我們用基于NMR的代謝組學(xué)方法比較了HFA仔豬大腸不同區(qū)域內(nèi)容物的代謝物組成，研究了大腸內(nèi)菌群代謝的空間分布規(guī)律。用1H NMR圖譜技術(shù)展示了10只37日齡的HFA仔豬的盲腸、近端結(jié)腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)容物和糞便中的生化組成，發(fā)現(xiàn)不同部位包含的代謝物種類相似，有很多細(xì)菌的代謝物，如短鏈脂肪酸、有機(jī)酸、酚酸、甲胺類物質(zhì)、各種氨基酸等；也有來自食物、宿主分泌或來源尚未確定的物質(zhì)，如碳水化合物、膽汁酸和核酸堿基。用多變量統(tǒng)計(jì)方法

9、，主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)、偏小二乘法(PartialLeast Square Discrimination Analysis，PLS-DA)和正交偏小二乘法(Orthogonal Projection on Latent Structure，O-PLS)區(qū)分大腸不同區(qū)域的內(nèi)容物和糞便的代謝物圖譜，發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸的含量從盲腸開始延大腸直至糞便逐漸降低，苯乙酸和3-羥基苯丙酸的含量在盲

10、腸和近端結(jié)腸中明顯高于遠(yuǎn)端結(jié)腸和糞便，支鏈氨基酸的含量從盲腸到糞便依次升高，糖苷類大分子的相對(duì)含量從盲腸到遠(yuǎn)端結(jié)腸逐漸升高。本研究表明，由于大腸不同部位的生理生態(tài)狀況不同，腸道菌群的代謝活動(dòng)也有差異。HFA仔豬大腸不同區(qū)段的內(nèi)容物中代謝物的變化與文獻(xiàn)報(bào)道的人類大腸內(nèi)容物的生化組成的變化趨勢(shì)相似，所以有潛力成為研究人腸道菌群代謝的有力模型?；贜MR的代謝組學(xué)方法可以快速展現(xiàn)腸道內(nèi)容物的代謝物組成，反映腸道菌群代謝活動(dòng)的概貌，可以用于監(jiān)測(cè)

11、腸道菌群的活動(dòng)，研究外來干預(yù)(如益生元、益生素等)對(duì)菌群代謝的影響。糞便中的代謝物組成不完全等同于大腸內(nèi)容物的情況，所以在下一步研究益生元對(duì)腸道菌群代謝的影響時(shí)，需要分析結(jié)腸內(nèi)容物中的代謝物組成的變化。
　　 為研究寡果糖對(duì)腸道菌群和宿主代謝的影響，5只對(duì)照組和5只益生元組仔豬在12日齡、17日齡、25日齡和37日齡的糞便，以及37日齡的近端結(jié)腸內(nèi)容物、遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)容物和尿液被采集。用NMR展示這些樣品的生化組成，用正交偏小二乘法

12、(Orthogonal Projection onLatent Structure，O-PLS)比較兩組仔豬的NMR圖譜。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組仔豬糞便的生化組成沒有顯著區(qū)別。在37日齡，益生元組仔豬的近端結(jié)腸內(nèi)容物中含有較高含量的低聚糖、葡萄糖、乙酸、丙酸和核酸堿基；但寡果糖主要影響了HFA仔豬遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)容物的代謝物組成，提高了低聚糖、葡萄糖、乙酸、乳酸、核酸堿基和多種氨基酸的含量，降低了膽汁酸的含量；益生元組仔豬的尿液中含有較高水平的丙氨

13、酸、甘氨酸、肌酸、磷酸肌酸、乳酸、檸檬酸，但尿囊素和尿素的含量較低，一些由腸道菌群或者由腸道菌群和宿主共代謝產(chǎn)生的代謝物，如二甲胺、苯乙酰甘氨酸、三甲胺、三甲胺氧化物、馬尿酸和4-羥苯基乳酸的含量在兩組仔豬尿液中有差異。從這些代謝變化推斷，寡果糖主要在HFA仔豬遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮益生元功效：寡果糖被結(jié)腸菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而影響了宿主的能量代謝；寡果糖調(diào)節(jié)菌群對(duì)氨基酸的代謝，影響了宿主的氨基酸代謝，改善宿主機(jī)體的氮平衡。寡果糖降低結(jié)腸