CNTFR在強(qiáng)直性脊柱炎中的表達(dá)變化及其對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種由多病因引起的復(fù)雜的疾病，可能與基因和環(huán)境等多種因素有關(guān)。強(qiáng)直性脊柱炎的患者大多數(shù)為年輕男性，其疾病特征為炎癥和關(guān)節(jié)僵直，部位主要累及脊柱及外周關(guān)節(jié)。HLA-B27作為與強(qiáng)直性脊柱炎(AS)相關(guān)性最強(qiáng)的基因已經(jīng)被研究了很多年，在過去的研究中雖取得了一定進(jìn)步，但在尋找疾病易感基因方面的研究進(jìn)展非常緩慢。和其他復(fù)雜性疾病如炎癥性腸病相比，AS可被識(shí)別的易感基因非常少。E

2、RAP1和IL23R的發(fā)現(xiàn)說明這些基因可能與關(guān)節(jié)僵直的發(fā)病有關(guān)。在全基因組學(xué)的相關(guān)研究中，辨別并證明相關(guān)基因及其變體是否與AS發(fā)病有關(guān)是一項(xiàng)非常難的挑戰(zhàn)。
　　成骨細(xì)胞在骨的形成以及骨的鈣化中起著重要作用，并且調(diào)節(jié)著破骨細(xì)胞的分化。骨髓干細(xì)胞中Runx2轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)，促使其分化為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化還通過巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，細(xì)胞核因子Kappa-B受體活化因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(OPG

3、)。巨噬細(xì)胞集落刺激因子使破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞池?cái)U(kuò)大，并增加它們的存活率。細(xì)胞核因子Kappa-B受體活化因子配體是破骨細(xì)胞形成的必備分子，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的RANK受體相互作用，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。骨保護(hù)素與細(xì)胞核因子Kappa-B受體活化因子配體相互作用，抑制破骨細(xì)胞的形成。其他影響成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞平衡關(guān)系的因子，還包括甲狀旁腺激素（parathyroid hormone PTH）和前列腺素E2(prostaglandin E

4、2 PGE2)。成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和細(xì)胞外基質(zhì)礦化過程，成骨細(xì)胞成熟及細(xì)胞外基質(zhì)成熟的重要標(biāo)志之一是堿性磷酸酶的活性，可采用ALP試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　當(dāng)阻斷CNTF時(shí)，可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失和運(yùn)動(dòng)綜合征，但是與VEGF丟失相比，它的損傷就相對(duì)較輕。在強(qiáng)直性脊柱炎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的區(qū)域，CNTF的表達(dá)相對(duì)性降低。另外在強(qiáng)直性脊柱炎病人的血清中，CNTF的水平逐漸升高

5、，尤其是當(dāng)腰椎受到侵犯時(shí)。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的小鼠模型中，皮下注射CNTF可以對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。CNTFR在骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，在外周組織中，骨骼肌、皮膚、肺、腸、腎、肝、脾和胸腺中都表達(dá)CNTFR，其中以骨骼肌中表達(dá)含量最高。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CNTFR表達(dá)在小腦，后腦、中腦、丘腦、下丘腦、紋狀體、海馬、皮質(zhì)等部位，其中以小腦的表達(dá)最高。CNTFR由CNTFRa、糖蛋白(gpl30)和LIFRβ三種成分構(gòu)成，其中CNTF

6、Ra是它的核心結(jié)構(gòu)，分子量大約在52kD左右。糖蛋白(gpl30)在IL-6家族中起著信號(hào)傳導(dǎo)的作用。LIFRβ是LIF的結(jié)合蛋白，LIFRβ的胞漿部分沒有蛋白激酶活性和GTP結(jié)合位點(diǎn)，但并行排列的信號(hào)傳遞體gpl30和LIFRβ與Jak-Tyk激活有關(guān)，故gpl30、LIFRβ與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。
　　我們通過基因芯片檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎病人與正常病人的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)C7、C3、ENTPD3、HBA2、FAM70A、 DSG2、AN

7、GPT1、ACVR1C、CNTFR、FMO2、RERGL、SLPI、IL7R、HP基因在強(qiáng)直性脊柱炎病人的髖關(guān)節(jié)韌帶中表達(dá)較正常病人表達(dá)增加。PAMR1、KCNA1、FGFBP2、PPP4R4、CRTAC1、MAMDC2、GPR64、GALNT13、F5、NOV、PIEZO2、LPAR4、CDH13、ITGA11、Q6ZUQ1、PIEZO2、ARNTL2、TNXB、NRK、GPSM2和HTR2A基因在強(qiáng)直性脊柱炎病人的髖關(guān)節(jié)韌帶中表達(dá)較

8、正常病人表達(dá)降低。其中CNTFR在骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，且在強(qiáng)直性脊柱炎病人中表達(dá)也升高，另外，當(dāng)阻斷CNTF時(shí)，可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失和運(yùn)動(dòng)綜合征，強(qiáng)直性脊柱炎病人的血清中，CNTF的水平逐漸升高，尤其是當(dāng)腰椎受到侵犯時(shí)。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的小鼠模型中，皮下注射CNTF可以對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。因此我們推測(cè)CNTFR可能與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)。成骨細(xì)胞在骨的形成以及骨的鈣化中起著重要作用，并且調(diào)節(jié)著破骨細(xì)胞的分化，在強(qiáng)直性脊柱炎

9、的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。成骨細(xì)胞成熟及細(xì)胞外基質(zhì)成熟的重要標(biāo)志之一是堿性磷酸酶的活性。因此用CNTF處理激活CNTFR，并用成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性檢測(cè)來觀察CNTFR是否與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)，理論上是可行的。
　　第一部分、強(qiáng)直性脊柱炎病人髖關(guān)節(jié)韌帶基因芯片的檢測(cè)
　　目的：探索與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的基因。
　　方法：我們對(duì)選取3例強(qiáng)直性脊柱炎病人和3例正常病人，取他們的髖關(guān)節(jié)韌帶，將組織送予公司檢測(cè)基因芯片，明確強(qiáng)直

10、性脊柱炎病人與正常病人基因表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：
　　┏━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┓
　　┃Symbol ┃ GeneBank ┃ Fold change ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ PAMR1 ┃NM_001001991.2 ┃ 0.29 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━

11、━━━━┫
　　┃ KCNA1 ┃ NM_000217.2 ┃ 0.31 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ FGFBP2 ┃ NM_031950.3 ┃ 0.31 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ PPP4R4 ┃ NM_020958.2 ┃ 0.33

12、 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ CRTAC1 ┃NM_001206528.2 ┃ 0.33 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃MAMDC2 ┃ NM_153267.4 ┃ 0.35 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ GPR64 ┃NM

13、_001079847.2 ┃ 0.37 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ GALNT13 ┃NM_001301627.1 ┃ 0.37 ┃
　　┣━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
　　┃ F5 ┃ NM_000130.4 ┃ 0.39 ┃
　　┗━━━━━┻━━━━━━━━┻

14、━━━━━━━━┛
　　┏━━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━┓
　　┃ NOV ┃ NM_002514.3 ┃ 0.4 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ PIEZO2 ┃ NM_022068.3 ┃ 0.41 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ LPAR4

15、 ┃NM_001278000.1 ┃ 0.42 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ CDH13 ┃NM_001220488.1 ┃ 0.46 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ ITGA11 ┃NM_001004439.1 ┃ 0.46 ┃
　　┣━━━━━━╋━━

16、━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ Q6ZUQ1 ┃NM_001010917.2 ┃ 0.46 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ PIEZO2 ┃ NM_022068.3 ┃ 0.47 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ ARNTL2 ┃NM_001248002.1

17、 ┃ 0.48 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ TNXB ┃ NM_019105.6 ┃ 0.49 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ NRK ┃ NM_198465.3 ┃ 0.49 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ GP

18、SM2 ┃ NM_013296.4 ┃ 0.5 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ HTR2A ┃ NM_000621.4 ┃ 0.5 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ C7 ┃ NM_000587.2 ┃ 2 ┃
　　┣━━━━━

19、━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ C3 ┃ NM_000064.3 ┃ 2.1 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ ENTPD3 ┃ NM_001248.3 ┃ 2.12 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ HBA2 ┃ NM_000517.4

20、 ┃ 2.12 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ FAM70A ┃NM_001104544.1 ┃ 2.21 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ DSG2 ┃ NM_001943.3 ┃ 2.23 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　

21、┃ ANGPT1 ┃ NM_001146.3 ┃ 2.23 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ ACVR1C ┃NM_001111031.1 ┃ 2.26 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ CNTFR ┃NM_001207011.1 ┃ 2.37 ┃
　　┣━

22、━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ FMO2 ┃NM_001301347.1 ┃ 2.49 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ RERGL ┃NM_001286201.1 ┃ 2.52 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ SLPI ┃ NM_003064.

23、3 ┃ 2.88 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ 1L7R ┃ NM_002185.3 ┃ 2.95 ┃
　　┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━┫
　　┃ HP ┃NM_001126102.1 ┃ 4.65 ┃
　　┗━━━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━━┛

24、r>　　結(jié)論：
　　C7、 C3、 ENTPD3、 HBA2、 FAM70A、 DSG2、 ANGPT1、 ACVR1C、 CNTFR、 FMO2、RERGL、 SLPI、 IL7R、 HP基因在強(qiáng)直性脊柱炎病人的髖關(guān)節(jié)韌帶中表達(dá)較正常病人表達(dá)增加。PAMR1、 KCNA1、 FGFBP2、 PPP4R4、 CRTAC1、 MAMDC2、 GPR64、 GALNT13、F5、 NOV、 PIEZO2、 LPAR4、 CDH13、

25、ITGA11、 Q6ZUQ1、 PIEZO2、 ARNTL2、 TNXB、NRK、 GPSM2和HTR2A基因在強(qiáng)直性脊柱炎病人的髖關(guān)節(jié)韌帶中表達(dá)較正常病人表達(dá)降低。
　　第二部分、驗(yàn)證強(qiáng)直性脊柱炎病人CNTFR基因的表達(dá)
　　目的：明確強(qiáng)直性脊柱炎病人CNTFR基因的表達(dá)。
　　方法：分別取2例強(qiáng)直性脊柱炎病人的髖關(guān)節(jié)韌帶作為實(shí)驗(yàn)組，和2例正常人的髖關(guān)節(jié)韌帶作為對(duì)照組，用western-blot法檢測(cè)CNTFR基因的

26、蛋白質(zhì)水平表達(dá)，比較兩組的差異。
　　結(jié)果：western-blot法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)直性脊柱炎病人髖關(guān)節(jié)韌帶中CNTFR蛋白的條帶顏色明顯比正常人的髖關(guān)節(jié)韌帶的深。
　　結(jié)論：強(qiáng)直性脊柱炎病人CNTFR基因的蛋白質(zhì)水平表達(dá)明顯升高第三部分 CNTF處理對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響目的明確CNTF處理對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響方法在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)成骨細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50％-70％時(shí)，進(jìn)行鋪板。將實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為C