ERK1-2和P-ERK1-2在膽管癌組織中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、膽管癌是一類嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤,且發(fā)病率逐年攀升。與許多其它惡性腫瘤一樣,膽管癌也是一種與癌基因激活和抑癌基因失活、細(xì)胞凋亡誘發(fā)基因和抑制基因調(diào)控失衡有關(guān)的、以細(xì)胞失控增殖為主要特征的基因病。而癌基因和抑癌基因的變異引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路失調(diào)則是膽管細(xì)胞癌變的主要機(jī)制之一,因此對(duì)膽管癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展過程中涉及到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究顯得非常重要。研究結(jié)果顯示多條信號(hào)傳導(dǎo)通路(如VEGF信號(hào)系統(tǒng),酪氨酸激酶受體相關(guān)信號(hào)系統(tǒng))均可

2、誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌變過程發(fā)生,其中Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路十分重要。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated ki-nase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kirtles,MAPK)家族成員之一,ERK家族有5個(gè)亞族,包括ERK1-ERK5。其中ERK1和ERK2途徑是ERK家族中研究最廣泛徹底的,屬于絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶,是細(xì)胞

3、信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑。能將多種細(xì)胞外信號(hào)(如生長因子、細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)因子等)通過磷酸化活化逐級(jí)傳遞至細(xì)胞核,并激活多種核轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及分化等。ERK1/2磷酸化后即P-ERK1/2,進(jìn)入細(xì)胞核作用于Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程,并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過

4、程中起重要作用。
　　 因此研究ERK1/2、P-ERK1/2兩者在膽管癌中的表達(dá),以及與膽管癌生物學(xué)行為的關(guān)系,具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。這也是我們開展此研究的目的所在。
　　 材料和方法：
　　 一、一般資料：標(biāo)本來源選擇中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科存檔石蠟包埋標(biāo)本(2005年1月-2009年10月)手術(shù)切除原發(fā)性肝外膽管癌標(biāo)本74例。所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行放化療,并經(jīng)病理確診膽管癌組織,對(duì)照為25例膽囊

5、結(jié)石膽囊管組織。病例標(biāo)本中男性例數(shù)為:45例,女性標(biāo)本為:29人,年齡23～73歲,平均61歲。按膽管癌病理分級(jí):高分化23例,中分化37例,低分化14例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為30例。按UICC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期,Ⅰ期24例,Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期25例。對(duì)照組病例中男性例數(shù)為:15例,女性標(biāo)本為:10人,年齡18～68歲。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法及試劑：
　　 (一)主要試劑：鼠抗人ERK1/2和P-ERK1/2

6、單克隆抗體購自NeoMarker公司；兔抗人HER-2多克隆抗體購自武漢博士德公司；SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)方法：用S-P法免疫組化染色,ERK1/2和P-ERK1/2一抗稀釋度均為1:100,二抗稀釋度均為1:200。陰性對(duì)照采用PBS液代替一抗,陽性對(duì)照采用北京中杉金橋公司提供的陽性片。
　　 (三)觀察：由兩位有經(jīng)驗(yàn)對(duì)病情不了解的病理科醫(yī)生觀察染色結(jié)果,ERK1/2的陽性著

7、色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；P-ERK1/2陽性表達(dá)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野,各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,共計(jì)1000個(gè),觀察著色強(qiáng)度并計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞百分率。ERK1/2陽性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):先按著色強(qiáng)度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分；再按陽性細(xì)胞所占百分比,無陽性細(xì)胞數(shù)為0分,陽性細(xì)胞數(shù)＜10％為1分,10％～50％為2分,＞50％為3分,參考Cooper等的報(bào)道:著色強(qiáng)

8、度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:0～3分為陰性(-),4～6分為弱陽性(+),7～9分為強(qiáng)陽性(++)。P-ERK1/2陽性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):先按著色強(qiáng)度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;再按陽性細(xì)胞所占百分比,參考Zhong等的報(bào)道:無陽性細(xì)胞數(shù)為0分,陽性細(xì)胞數(shù)＜1％為1分,1％～10％為2分,10％～50％為3分,＞50％為4分；著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:0～3分為陰性(一),4～6分為弱陽性(+),7～9分為中度陽性(++

9、),10～12分為強(qiáng)陽性(+++)。
　　 (四)隨訪結(jié)果：定義從手術(shù)后到病人死亡的時(shí)間為生存時(shí)間,時(shí)間的測度單位(月)。設(shè)定2010年9月1日為截止隨訪日,對(duì)于中途失訪患者,其終止時(shí)間以最后一次訪問時(shí)間為準(zhǔn)。采用電話隨訪跟蹤,失訪16例,因膽管癌死亡50例,失訪者為失去聯(lián)系患者。
　　 (五)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。ERK1/2和P-ERK-1/2表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性采用Pearson卡

10、方檢驗(yàn),應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,單因素分析采用Kaplan-Meier模型,多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、ERK1/2和P-ERK1/2在膽管癌組織中表達(dá)情況：74例肝外膽管癌組織中ERK1/2和P-ERK1/2蛋白陽性表達(dá)率分別為32.4％(24/74)和60.8％(45/74)(圖1-7)；在25例正常肝外膽管組織中,ERK1/2和P-ER

11、K1/2蛋白表達(dá)陽性表達(dá)率分別為16％(4/25)和24％(6/25)(圖8)；與正常肝外膽管組織比較,膽管癌組織ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表達(dá)陽性表達(dá)率均顯著高于正常肝外膽管組織(P＜0.05)。
　　 二、ERK1/2和P-ERK1/2表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性：ERK1/2蛋白表達(dá)與肝外膽管癌患者年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度比較后,均未見相關(guān)性。P-ERK1/2蛋白表達(dá)與肝外膽管癌患者淋

12、巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關(guān):淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝外膽管癌組織中P-ERK1/2蛋白表達(dá)陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽管癌患者(76.7％vs.50％,x2=5.323,P=0.021)；P-ERK1/2蛋白表達(dá)陽性在分化程度低的膽管癌組織中表達(dá)明顯高于分化程度高的患者(x2=8.435,P=0.015)。P-ERK1/2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、患者年齡、性別比較均未見相關(guān)性(表1)。
　　 三、ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)與膽管

13、癌患者預(yù)后的相關(guān)性：為了觀察ERK1/2和P-ERK1/2表達(dá)與肝外膽管癌患者預(yù)后的相關(guān)性,我們對(duì)ERK1/2和P-ERK1/2表達(dá)與肝外膽管癌患者的總體生存期進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,生存分析結(jié)果顯示,ERK1/2表達(dá)水平與肝外膽管癌患者的總體生存期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖9):P-ERK1/2表達(dá)陽性患者總體生存期明顯短于P-ERK1/2表達(dá)陰性的肝外膽管癌患者(P=0.034,圖10)
　　 結(jié)論：膽管癌組織存在ERK1/2和