狂犬病病毒L蛋白K1685和K1829對病毒致病性和免疫逃避的作用及機制.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引起的一種古老的人畜共患傳染病，全世界每年約有55000人死于狂犬病，主要發(fā)生在非洲和亞洲一些發(fā)展中國家，我國是狂犬病高發(fā)國家之一。
　　RABV為單股負鏈RNA病毒，其基因組共編碼五個結(jié)構(gòu)蛋白，分別是N、P、M、G和L蛋白，其中L蛋白的研究甚少。通過對其它單股負鏈RNA病毒的L蛋白的相關(guān)研究，尤其是與RABV同屬于彈狀病毒科的水皰性口炎病毒(VSV)，表明L蛋白含有K-D-K-E的保守催化四聚體區(qū)

2、域，該區(qū)域主要在病毒mRNA加帽過程中行使N-7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)的功能，預(yù)計會在病毒的致病性及病毒逃逸宿主的先天性免疫中起到重要作用。
　　本研究首先利用在線軟件ClustalW2對RABV、VSV、麻疹病毒、仙臺病毒、新城疫病毒和尼帕病毒的L蛋白羧基端進行序列比對，結(jié)果表明RABV的L蛋白中也存在K-D-K-E四聚體區(qū)域，且四個關(guān)鍵氨基酸K、D、K、E是完全保守的。此外，進一步通過比較RABV不同毒株之間的L蛋

3、白中的K-D-K-E四聚體區(qū)域，發(fā)現(xiàn)該保守區(qū)域在不同的RABV毒株間是高度保守的。
　　為了探索該K-D-K-E四聚體區(qū)域在RABV的致病性及逃逸宿主先天性免疫方面的作用，我們利用反向操作技術(shù)將該保守四聚體區(qū)域中的四個關(guān)鍵氨基酸位點K（第1685位）、D（第1797位）、K（第1829位）、E（第1867位）分別進行突變，構(gòu)建一系列的重組狂犬病病毒(rRABV)，并將這些重組病毒與親本病毒在致病性上進行體外和體內(nèi)的比較。體外實驗表

4、明，D1797和E1867突變的rRABV(rB2c-K1797A和rB2c-K1867A)體外擴增2代時便會快速回復(fù)突變?yōu)橛H本型，而K1685和K1829突變的rRABV(rB2c-K1685A和rB2c-K1829A)的遺傳性狀則比較穩(wěn)定，細胞傳代擴增至15代仍未發(fā)生回復(fù)突變，因此，本研究將以rB2c-K1685A和rB2c-K1829A兩個突變毒株為主要研究對象。病毒體外生長曲線結(jié)果表明兩個突變毒株的病毒滴度和在細胞中的擴散能力都

5、要明顯低于親本毒株;在對小鼠的致病性實驗中發(fā)現(xiàn)，無論是以后肢肌肉注射方式還是腦內(nèi)注射方式進行感染，rB2c-K1685A和rB2c-K1829A都不能致成年小鼠發(fā)病;且其對乳鼠的致病性（體重變化、臨床癥狀、死亡率）顯著低于親本毒株rB2c。
　　為了研究這些突變了K-D-K-E四聚體區(qū)域的重組病毒是否對病毒逃逸宿主先天性免疫方面也產(chǎn)生影響，我們將這些突變的重組病毒與親本病毒在誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（interferon, IFN）的產(chǎn)生及

6、對其敏感性方面進行了比較，結(jié)果表明與親本病毒相比，rB2c-K1685A和rB2c-K1829A對Ⅰ型IFN敏感性增加，但其在感染RAW264.7細胞后并未誘導(dǎo)更多的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。研究表明IFIT1/2等干擾素刺激因子(interferon stimulated gene，ISG)可以對一些2'-O MTase缺陷的病毒復(fù)制產(chǎn)生影響，為了研究突變的rRABV是否也受這些ISG的影響，我們分別構(gòu)建了過表達IFIT1和IFIT2的細胞系

7、，用重組病毒感染這些細胞，結(jié)果表明過表達IFIT1并不能明顯抑制重組病毒的復(fù)制，而過表達IFIT2則能顯著抑制重組病毒的復(fù)制。
　　為了進一步研究K-D-K-E四聚體區(qū)域的突變是否對病毒的免疫原性產(chǎn)生影響，我們將重組病毒和親本病毒分別免疫小鼠，并于免疫后第2周進行病毒中和抗體(VNA)滴度的測定，發(fā)現(xiàn)重組病毒和親本病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的VNA均值都在10 IU/ml，在免疫后第3周用CVS-24進行攻毒實驗，重組病毒rB2c-K1829A

8、可以達到90％的保護率，而rB2c-K1685A和親本病毒都能達到100％的免疫保護率。以上結(jié)果表明K-D-K-E四聚體區(qū)域的突變對病毒的免疫原性未有顯著影響。
　　綜上所述，K-D-K-E四聚體區(qū)域的突變對可以顯著降低RABV的致病性，使其對Ⅰ型IFN以及IFIT2更為敏感，但并未顯著影響病毒的免疫原性。該研究將對進一步理解L蛋白的K-D-K-E四聚體區(qū)域在RABV的致病性和逃逸宿主先天性免疫方面的作用機制奠定基礎(chǔ)，同時也為RA