狂犬病病毒屬7種主要病毒檢測(cè)芯片的研制.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒屬(Lyssavirus,Lv)引起的所有溫血?jiǎng)游锒家赘械牧倚詡魅静　Ｄ壳霸搶儆?4種病毒,包括國(guó)際病毒分類委員會(huì)(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)公布的12種Lv,分別為7種主要Lv和5種新定Lv,以及最新發(fā)現(xiàn)的2種待定的Lv。除第2種,及5種新定Lv和2種新發(fā)現(xiàn)的病毒未見報(bào)道外,其他Lv成員都能引起人的狂犬病。本實(shí)驗(yàn)所涉及Lv的7種主要病毒分別為:第1

2、種Lv,經(jīng)典狂犬病病毒(Classicrabiesvirus,RABV);第2種Lv,拉各斯蝙蝠病毒(Lagosbatvirus,LBV);第3種Lv,蒙哥拉病毒(Mokolavirus,MOKV);第4種Lv,杜文哈根病毒(Duvenhagevirus,DUVV);第5種Lv,歐洲蝙蝠狂犬病病毒1型(Europeanbatlyssavirus1,EBLV-1);第6種Lv,歐洲蝙蝠狂犬病病毒2型(Europeanbatlyssavir

3、us2,EBLV-2);第7種Lv,澳大利亞蝙蝠病毒(Australianbatlyssavirus,ABLV)。目前99.8％的人和動(dòng)物的狂犬病是由這7種主要Lv引起。
　　OIE推薦的狂犬病確診金標(biāo)方法―動(dòng)物腦組織直接免疫熒光(FAT)不能對(duì)Lv鑒別。目前對(duì)Lv鑒別檢測(cè)的分子檢測(cè)技術(shù),如RT-PCR、RT-qPCR、PCR結(jié)合測(cè)序等方法,存在著檢測(cè)通量低、靈敏度不高、特異性不強(qiáng)和費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。因此,建立一種對(duì)7種主要Lv快速

4、檢測(cè)和鑒別的方法尤為必要。基因芯片技術(shù)為病毒性傳染病診斷提供了高效、特異和自動(dòng)化的方法,其原理為將已知核酸序列按照一定矩陣點(diǎn)制到固相載體上,這些探針再和具有熒光標(biāo)記的核酸靶標(biāo)雜交,雜交結(jié)果通過具有相應(yīng)熒光激發(fā)波長(zhǎng)的掃描儀獲取。
　　本研究目的：建立一種對(duì)7種主要Lv快速、靈敏檢測(cè)和鑒別的基因芯片方法,并用狂犬病疑似臨床樣品對(duì)建立的方法評(píng)估。
　　方法：根據(jù)目前7種主要Lv的N基因編碼區(qū)62-442nt片段設(shè)計(jì)Lv特異寡核苷酸

5、探針,每個(gè)種設(shè)計(jì)多條探針使之在最大程度上覆蓋該種所有變異株。寡核苷酸探針長(zhǎng)度為60-70nt,允許一定數(shù)量的堿基錯(cuò)配,可用于檢測(cè)同源性高的新變異株。使用可擴(kuò)增Lv所有種的巢式RT-PCR(RT-nPCR),擴(kuò)增標(biāo)記N基因的62-442nt片段,以提高芯片的檢測(cè)靈敏度。比較評(píng)估基因芯片方法和目前常規(guī)狂犬病診斷方法在狂犬病臨床樣品檢測(cè)中的靈敏性和特異性。
　　本課題的主要結(jié)果：
　　1、探針設(shè)計(jì)及篩選
　　本研究選取206

6、條Lv各種具有代表性毒株N基因序列作為芯片探針設(shè)計(jì)的參考序列,與Lv同源性極低的E.colipGM-T質(zhì)粒和擬南芥的一段基因組作為對(duì)照探針設(shè)計(jì)參考序列,共設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為60-70nt,Tm值為75±5℃的寡核苷酸探針78條,對(duì)照探針7條。通過BLAST及標(biāo)準(zhǔn)參考毒株篩選驗(yàn)證,最終確定50條種特異探針和7條對(duì)照探針用以構(gòu)建Lv芯片,命名為:“LyssaChip”。
　　2、LyssaChip設(shè)計(jì)
　　在對(duì)LyssaChip探針點(diǎn)

7、樣矩陣設(shè)計(jì)時(shí),為方便芯片雜交結(jié)果觀察,我們?cè)O(shè)計(jì)了“表盤式”探針點(diǎn)樣模式。該模式為:中心與四角4個(gè)探針點(diǎn)為綠色熒光標(biāo)記探針,用于定位“表盤”位置,共8個(gè)點(diǎn);點(diǎn)樣圖12點(diǎn)鐘方向?yàn)殛?yáng)性對(duì)照探針6個(gè)點(diǎn)、陰性對(duì)照探針6個(gè)點(diǎn);1點(diǎn)到2點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第1種(RABV)探針點(diǎn)陣,共12個(gè);3點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第2種(LBV)探針點(diǎn)陣,共14個(gè);4點(diǎn)到5點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第3種(MOKV)的探針點(diǎn)陣,共17個(gè);6點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第4種(DUVV)探針點(diǎn)陣,共12個(gè)

8、;7點(diǎn)到8點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第5種(EBLV-1)探針點(diǎn)陣,共12個(gè);9點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第6種(EBLV-2)探針點(diǎn)陣,共22個(gè);10點(diǎn)到11點(diǎn)鐘方向?yàn)長(zhǎng)v第7種(ABLV)探針點(diǎn)陣,共14個(gè)。每個(gè)探針點(diǎn)均為2個(gè)重復(fù),每種均有6到11條探針,以期在最大程度上檢測(cè)各種Lv的所有亞型。
　　為提高LyssaChip檢測(cè)通量,我們?cè)谝粡埿酒c(diǎn)制12個(gè)“表盤式”探針點(diǎn)陣,同時(shí)用于12份樣品檢測(cè),可以完成中通量的檢測(cè)任務(wù)。
　　3、Lyss

9、aChip構(gòu)建及優(yōu)化
　　所有寡核苷酸探針經(jīng)氨基化修飾,用芯片點(diǎn)樣儀印跡于醛基化修飾的玻璃基片上,制備芯片。通過優(yōu)化標(biāo)記樣品制備、雜交液配置和雜交條件,確定了LyssaChip標(biāo)準(zhǔn)使用流程:常規(guī)方法提取樣品RNA,用HEX修飾過的引物擴(kuò)增標(biāo)記靶核酸;用12μL雜交緩沖液(99%甲酰胺、1×SSC、2%SDS、50×Denhardt’s、標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照各2μL,補(bǔ)水至12μL)混合8μl熒光標(biāo)記樣品,43℃雜交3.5h;用芯片掃描儀讀

10、取雜交結(jié)果,陽(yáng)性點(diǎn)定義:SNR≥2,且F532Median-B532≥800,反之為陰性點(diǎn)。
　　4、LyssaChip驗(yàn)證及評(píng)估
　　用Lv的1-7種參考滅活病毒驗(yàn)證,LyssaChip方法可準(zhǔn)確而特異地鑒別區(qū)分這7種參考毒株。
　　LyssaChip可檢測(cè)最低cDNA模板濃度:RABV,LBV,MOKV,DUVV,EBVV-1,和ABLV為2.46×105molecules/μl;EBLV-2為2.46×104mo

11、lecules/μl;可檢測(cè)最低狂犬病標(biāo)準(zhǔn)SRV9疫苗細(xì)胞毒滴度為0.158個(gè)TCID50/ml,其靈敏度是本實(shí)驗(yàn)已建立RT-nPCR和RT-qPCR方法的10倍。
　　對(duì)RABV,DUVV,EBLV-2,ABLV滅活病毒模擬臨床多重感染試驗(yàn)表明,LyssaChip具有同時(shí)檢測(cè)樣品中不同種病毒交叉感染的能力。對(duì)LyssaChip保存期(第30、60、90、150和210天)和保存環(huán)境(-20℃、4℃和常溫20±2℃)試驗(yàn)評(píng)估,確定

12、LyssaChip最佳保存條件和時(shí)間為-20℃避光保存,有效期至少為150天。
　　5、LyssaChip應(yīng)用
　　本研究用LyssaChip檢測(cè)臨床樣品共111份,其中65份為2004-2010年間本實(shí)驗(yàn)室保存的狂犬病臨床疑似動(dòng)物腦組織樣品(犬、牛、羊、貉),46份犬腦組織樣品為2010年湖南動(dòng)物疾控中心送檢的采集于寧遠(yuǎn)縣和衡陽(yáng)市部分狗肉館的樣本。這111份臨床疑似樣品分別使用金標(biāo)方法FAT、常規(guī)RT-nPCR和Lyssa

13、Chip鑒定。相對(duì)于金標(biāo)方法FAT,LyssaChip表現(xiàn)出很高的靈敏性(CI:94.48%-100%)和特異性(CI:82.10%-98.63%)。經(jīng)過Kappa一致性檢驗(yàn),LyssaChip與金標(biāo)方法FAT具有非常高的一致性(κ=0.944);McNemarχ2差異性檢驗(yàn)結(jié)果表明,這兩種方法之間不一致部分(3份FAT陰性,LyssaChip陽(yáng)性)的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),說明LyssaChip陽(yáng)性檢出率更高。另外,L

14、yssaChip結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-nPCR方法同樣表現(xiàn)出非常高的一致性(κ=0.981)。
　　在2010年歐盟舉行的國(guó)際狂犬病實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)中,我們使用LyssaChip方法準(zhǔn)確檢測(cè)出送檢的7份盲樣中陽(yáng)性和陰性樣品,并成功鑒別出陽(yáng)性樣品中4種Lv,分別為RABV,EBLV-1,EBLV-2,ABLV。該方法與同時(shí)應(yīng)用于盲樣檢測(cè)的FAT、RT-nPCR和RT-qPCR方法的共同陽(yáng)性檢出樣品完全符合;所不同的是相對(duì)于RT-

15、qPCR,LyssaChip多檢出4種Lv感染的樣品;相對(duì)于FAT和RT-nPCR,LyssaChip區(qū)分出了樣品中病毒的種類。
　　本課題研制的LyssaChip可應(yīng)用于快速、高通量檢測(cè)和區(qū)分臨床樣品中7種Lv主要病毒。一張LyssaChip可同時(shí)檢測(cè)12份樣品,所需操作時(shí)間不到8小時(shí),其中包括:1小時(shí)RNA提取,3小時(shí)RT-nPCR,3.5小時(shí)芯片雜交和30分鐘芯片洗滌和掃描。而同樣工作,傳統(tǒng)基于RT-nPCR產(chǎn)物測(cè)序方法是不