狂犬病病毒基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、病毒粒子出芽和微管解聚的功能研究.pdf

1、狂犬病病毒（rabies virus，RABV）是彈狀病毒科狂犬病毒屬成員，是當(dāng)今世界人和動(dòng)物狂犬病的致病原，具有高度嗜神經(jīng)性和致死性。在RABV感染病例的腦組織中常出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性及細(xì)胞骨架發(fā)生改變，但目前該病毒的致病機(jī)制仍遠(yuǎn)不明了。本研究利用RABV體外感染模型，研究了病毒基質(zhì)蛋白(M)與線(xiàn)粒體凋亡通路之間的關(guān)系、M蛋白介導(dǎo)子代病毒粒子出芽過(guò)程中與細(xì)胞微絲骨架之間的關(guān)系以及RABV感染對(duì)微管骨架的影響，旨在為深入研究RABV的致病機(jī)

2、制和尋找潛在藥物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　細(xì)胞凋亡作為機(jī)體重要的防御機(jī)制之一，在機(jī)體清除體內(nèi)病毒的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在病毒與宿主相互抗?fàn)幍倪^(guò)程中，病毒進(jìn)化出一系列策略調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡。一些病毒在感染早期能夠抑制凋亡，進(jìn)而促進(jìn)病毒的感染和復(fù)制;而一些病毒在感染晚期利用凋亡，促進(jìn)病毒擴(kuò)散和傳播。本研究以狂犬病病毒高致病力毒株CVS感染鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a為模型，解析了RABV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路。Caspase酶活性檢測(cè)結(jié)合共聚焦實(shí)

3、驗(yàn)結(jié)果表明，RABV感染激活caspase-9并導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)的促凋亡蛋白cyto c和AIF分別移位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。由此說(shuō)明RABV感染激活依賴(lài)和非依賴(lài)caspase的線(xiàn)粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。構(gòu)建病毒蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)表達(dá)病毒M蛋白導(dǎo)致線(xiàn)粒膜電勢(shì)下降以及caspase-9和-3的酶活性顯著升高，與RABV感染的結(jié)果相似。共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在RABV感染的細(xì)胞中或單獨(dú)表達(dá)M蛋白的細(xì)胞中，部分M蛋白與線(xiàn)粒體呈共定

4、位關(guān)系。構(gòu)建M蛋白的截短突變體并結(jié)合共聚焦和TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M蛋白的67aa～79aa所形成的的α-螺旋結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)M蛋白的線(xiàn)粒體定位和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由此表明病毒M蛋白直接作用于線(xiàn)粒體，消耗線(xiàn)粒體膜電勢(shì)，激活線(xiàn)粒體凋亡通路。
　　M蛋白除了作用于線(xiàn)粒體外，本研究利用共聚焦顯微鏡還觀(guān)察了M蛋白在細(xì)胞膜處介導(dǎo)子代病毒粒子出芽的動(dòng)態(tài)過(guò)程。M蛋白在感染4h分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在感染8h于細(xì)胞膜處出現(xiàn)明顯的聚集，在感染12h于細(xì)胞膜處形成囊泡

5、突向細(xì)胞外，而在16h囊泡脫離細(xì)胞膜，釋放到胞外，說(shuō)明M蛋白已完成介導(dǎo)子代病毒粒子的出芽和釋放。進(jìn)一步對(duì)RABV感染的細(xì)胞圖像進(jìn)行細(xì)節(jié)放大后可見(jiàn)M蛋白在細(xì)胞膜處形成的出芽囊泡與微絲呈現(xiàn)明顯共定位。藥物處理破壞微絲骨架導(dǎo)致M蛋白形成的出芽囊泡在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)大量滯留且細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度顯著下降，由此證實(shí)M蛋白在細(xì)胞膜處介導(dǎo)子代病毒粒子的出芽依賴(lài)于微絲骨架。
　　此外，通過(guò)共聚焦實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)RABV感染誘導(dǎo)微管解聚且病毒M蛋白形成絲狀

6、結(jié)構(gòu)。有趣的是，凡是在M蛋白形成絲狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中，微管骨架都發(fā)生解聚。藥物處理微管骨架發(fā)現(xiàn)，解聚微管促進(jìn)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，而穩(wěn)定微管卻抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制并抑制M蛋白絲狀結(jié)構(gòu)的形成。WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RABV感染上調(diào)去乙?；窰DAC6的表達(dá)水平，導(dǎo)致微管乙酰化修飾水平下調(diào)。藥物抑制HDAC6的去乙?；富钚燥@著抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。此外，單獨(dú)表達(dá)病毒M蛋白顯著誘導(dǎo)微管解聚。這些結(jié)果說(shuō)明，RABV感染誘導(dǎo)微管解聚，促進(jìn)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制;病毒M