中國(guó)HIV-AIDS患者tat基因變異特點(diǎn)及與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、該研究擬通過(guò)該院艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室?guī)啄陙?lái)收集的22例HIV感染者及AIDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),對(duì)基因組中整合的HIV-1前病毒DNA反式激活蛋白Tat第一外顯子的基因序列擴(kuò)增、測(cè)定和分析,明確中國(guó)HIV-1感染者中病毒基因組中tat區(qū)第一外顯子基因序列的特征;病毒核苷酸和氨基酸突變的種類(lèi)及變化;探討HIV-1 tat區(qū)第一外顯子基因突變與病毒進(jìn)展程度的相關(guān)性.材料和方法:收集中國(guó)HIV感染者的流行病學(xué)資料,臨床資料及全血標(biāo)本

2、-70℃.HIV-1 tat基因第一外顯子基因序列測(cè)定:Qiaquick Spin kit從全血標(biāo)本中提取基因組DNA(含有整合的HIV-1前病毒DNA),提取的DNA以tat調(diào)節(jié)基因區(qū)特異性引物NP7/ENV-1為外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,以tat-B/NP11為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行nested-PCR擴(kuò)增.1﹪瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的擴(kuò)增片斷,與分子量Marker對(duì)比無(wú)誤后切取該片斷.QIAquick Gel Extraction Kit

3、回收目的DNA片斷.LI-COR Global IR2 System測(cè)序儀進(jìn)行基因序列測(cè)定.不同疾病進(jìn)展階段的HIV-1感染者體內(nèi)HIV-1核苷酸及氨基酸序列特征分析:按不同疾病進(jìn)展階段對(duì)中國(guó)HIV-1感染者進(jìn)行分組.使用BIOEDIT軟件包中CLASTAL W程序進(jìn)行序列排列比對(duì)、生成共享序列,并在核苷酸序列中人工引入gaps以保持翻譯完整性.以PHYLIP軟件包中DNADIST(Kimura's two parameters met

4、hod)計(jì)算毒株間核苷酸及氨基酸離散率,并在此基礎(chǔ)上以NEIGHBOR程序生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(neighbor-joining algorithm).統(tǒng)計(jì)tat調(diào)節(jié)基因區(qū)第一外顯子核苷酸及氨基酸突變位置和種類(lèi),并檢索HIV Sequence Database,與國(guó)內(nèi)外HIV流行株序列進(jìn)行比較,結(jié)合CD4計(jì)數(shù)資料分析HIV-1基因突變與疾病進(jìn)展程度之間的關(guān)系.結(jié)論:1.中國(guó)AIDS人群中,B'和B'/C重組亞型HIV-1tat基因第一外顯子氨