中國HIV-AIDS患者外周血單個核細(xì)胞APOBEC3G表達(dá)水平及病毒Vif變異與疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：機(jī)體天然免疫系統(tǒng)在抵御HIV感染中發(fā)揮重要作用，APOBEC3G(Apolipoprotein B mRNA-editing Enzyme，Catalytic Polypeptide-like3G)是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)天然免疫因子，具有抑制HIV Vif缺失病毒(HIV△vif)復(fù)制的能力。Vif(Virion Infectivity Factor)是HIV-1病毒的調(diào)節(jié)蛋白之一，以細(xì)胞依賴方式在新生病毒的組裝、釋放或者成熟階段增加其

2、感染性。體外實驗顯示，APOBEC3G通過誘導(dǎo)HIV△vif病毒逆轉(zhuǎn)錄過程中生成的cDNA，將胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃT導(dǎo)病毒基因組DNA的致死性突變而抑制病毒復(fù)制。但當(dāng)病毒Vif蛋白存在時，可通過阻止APOBEC3G組裝入病毒顆粒以及誘導(dǎo)泛素化降解等途徑來拮抗APOBEC3G。當(dāng)Vif重要氨基酸位點發(fā)生改變時，其對APOBEC3G的降解作用明顯減弱或完全喪失。
　　 方法：
　　 1.研究對象
　　 由河南省

3、疾病預(yù)防與控制中心以及中國醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所艾滋病確認(rèn)實驗室經(jīng)Western blot試驗確認(rèn)為陽性，未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者。調(diào)查與采血前征得患者同意，并簽訂知情同意協(xié)議?；颊哐獫{標(biāo)本病毒核酸經(jīng)套式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增gag-pol區(qū)，序列測定和分析確定為B'亞型。根據(jù)HIV/AIDS患者感染時間和CD4+T細(xì)胞數(shù)量分為緩慢進(jìn)展組(Slow Progressor，SP)：感染時間＞10年，未經(jīng)抗病毒治療，CD4+T細(xì)胞數(shù)量＞

4、500個/μl；典型進(jìn)展HIV組(HIV)：感染時間＞5年，CD4+T細(xì)胞數(shù)量介于200～500個/μl，無艾滋病指征性疾??；典型進(jìn)展AIDS組(AIDS)：感染時間＞5年，CD4+T細(xì)胞數(shù)＜200個/μl，和/或合并艾滋病指征性疾病。HIV抗體陰性健康對照來自河南省。
　　 2.CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)
　　 應(yīng)用美國BECTON DICKINSON公司的流式細(xì)胞儀(FACSCALIBUR)測定CD4+、CD8+、CD3

5、+T淋巴細(xì)胞絕對值。將20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST試劑加入CD4絕對計數(shù)管，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動分析。
　　 3.病毒載量測定
　　 用200μl病人血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自

6、動載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。HIV病毒載量經(jīng)log10對數(shù)轉(zhuǎn)化后用于統(tǒng)計分析。
　　 4.標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 取健康人EDTA抗凝全血5ml，常規(guī)提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini kit提取細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA，按照Promega公司的ImProm-ⅡTMReverse Transcription System說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增APOBEC3G

7、和GAPDH開放讀碼框架全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)菌中，藍(lán)白篩選后獲得陽性克隆，測序驗證，純化重組質(zhì)粒，紫外分光光度計定量后根據(jù)分子量換算為分子拷貝數(shù)，10倍系列稀釋質(zhì)粒制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
　　 5.實時定量PCR檢測APOBEC3G mRNA水平
　　 取健康對照和HIV感染者EDTA抗凝全血10ml，常規(guī)提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini ki

8、t提取細(xì)胞總RNA。選用Promega公司的ImProm-ⅡTM Reverse Transcription Systerm和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。APOBEC3G(NM021822)和內(nèi)參GAPDH(NM002046.3)特異性探針序列為FAM-GCAACCAGGCTCCACATAAACACGG-NFQ；FAM-GGACTCATGACCACAGTCCATGCCA-NFQ。25μl實時PCR反應(yīng)體系：2×TaqMan(R)Univ

9、ersal PCR Master Mix12.5μl，20×TaqMan Gene Expression Assay1.25μl、無RNase/DNase水9.25μl、cDNA2μl。應(yīng)用ABI7500實時PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s、60℃1 min40循環(huán)。APOBEC3G和GAPDH mRNA絕對拷貝數(shù)由系列稀釋的質(zhì)粒構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得，每份標(biāo)本設(shè)2個復(fù)孔結(jié)果取均值。
　　

10、 6.Western blot方法檢測PBMC中APOBEC3G蛋白量
　　 將PBMC置于冰上，加入裂解液，充分裂解細(xì)胞后，4℃，12000rpm/min離心20min，將上清吸到另一個Eppendorf管中，Lowry法蛋白定量。加入3×上樣buffer混合，煮沸5分鐘，冷卻后取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后通過半干式轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，按預(yù)染標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入兔抗人APOBEC3

11、G(1：200)、GAPDH(1：2000)一抗，37℃孵育1h，4℃過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃30min，ECL發(fā)光顯色，圖像采集及分析處理。
　　 7.套氏聚合酶鏈反應(yīng)(Nest-PCR)擴(kuò)增HIV-1前病毒Vif全長及序列分析
　　 (1)套氏聚合酶鏈反應(yīng)(Nest-PCR)擴(kuò)增HIV-1前病毒Vif基因
　　 取每例感染者全血1ml，應(yīng)用QIAamp Blood kit(Qiagen)

12、提取前病毒基因組DNA。取5μlDNA進(jìn)行Nest-PCR擴(kuò)增。外側(cè)引物序列為Po15：GAAGCCATGCATGGACAGGT，Vif2：AGGCTGACTTCCTGGATG。內(nèi)側(cè)引物序列為Vif3：CATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAG，Vif4：TCTTAAGCTCCTCTAAAAGCTC。取PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)與marker比對，確認(rèn)所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit試劑

13、盒純化基因片段。將純化后的PCR產(chǎn)物，以Vif3、Vif4為測序引物，使用美國Applied Biosystem公司的BigDye TerminatorSequencing試劑盒和ABI377型DNA測序儀進(jìn)行測序。
　　 (2)Vif核苷酸和氨基酸序列特征分析
　　 下載HIV序列庫(http://www.hiv.lanl.gov)中各亞型國際、國內(nèi)HIV-1Vif序列，用BIOEDIT軟件包中CLASTAL W程序?qū)?/p>

14、下載序列及測得序列進(jìn)行排列比對。以phylogeny工具鄰位相連法(Neighbor-Joining)生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用Translation程序?qū)⒑塑账嵝蛄蟹g成蛋白質(zhì)的氨基酸序列并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，分析各氨基酸位點的變化。
　　 8.體外SF33感染PBMC和IFN-α刺激實驗
　　 Ficoll密度梯度離心法分離健康人和HIV感染者PBMC，常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中(37℃，5％CO

15、2)。實驗組細(xì)胞分別感染500TCID50的SF33和/或加入終濃度為100U/ml、400U/ml、800U/ml的IFN-α，于培養(yǎng)不同時間點收集培養(yǎng)上清于-20℃凍存，用于p24檢測；同時收集孔內(nèi)細(xì)胞于15ml離心管，1000rpm/min離心10分鐘，PBS洗滌2次，棄盡上清，分別提取細(xì)胞總RNA和蛋白，用于APOBEC3G的mRNA和蛋白檢測。
　　 9.培養(yǎng)上清p24檢測
　　 采用Biomerieux公司p

16、24ELISA檢測試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。
　　 10、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，病毒載量經(jīng)log10對數(shù)轉(zhuǎn)換后用于統(tǒng)計學(xué)分析。研究對象不同分組APOBEC3G表達(dá)差異采用單因素方差分析，并進(jìn)行均數(shù)兩兩比較；表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量、病毒載量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。組間氨基酸取代頻率的差異比較采用Fisher's精確概率檢驗。氨基酸

17、位點有無取代兩組間CD4+T細(xì)胞數(shù)和病毒載量的組間比較采用均數(shù)t檢驗。
　　 結(jié)論:
　　 1.中國HIV/AIDS患者外周血單個核細(xì)胞APOBEC3G表達(dá)水平與疾病進(jìn)展密切相關(guān)；高水平的APOBEC3G對感染HIV后疾病緩慢進(jìn)展具有保護(hù)作用。
　　 2.中國HIV/AIDS患者HIV-1Vif與APOBEC3G作用的重要氨基酸位點相對保守。Vif序列中V7A取代與低病毒載量、高CD4+T細(xì)胞數(shù)有關(guān)；F39V取代