藤茶PAL特性及其與黃酮和DMY含量變化相關(guān)性的研究.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要催化由苯丙氨酸(Phe)到各種酚類物質(zhì)，為多種酚類及類黃酮終產(chǎn)物提供前體，是酚類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶。本文在優(yōu)化藤茶PAL粗酶提取和活性檢測(cè)條件的基礎(chǔ)上，對(duì)藤茶PAL的分離純化和相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并比較分析了江西、湖南、恩施來源的1芽1葉，3、4葉和莖在不同時(shí)期PAL的活性與黃酮和二氫楊梅素(DMY)含量變化的相關(guān)性，為今后深入研究藤茶黃酮和DMY形成機(jī)理提供理論依據(jù)。 1.藤茶PAL提取和活性分析

2、條件的優(yōu)化。 以L-苯丙氨酸(L-Phe)為底物，對(duì)藤茶PAL粗酶提取和活性分析條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入量對(duì)酶活性影響較大。隨著PVP加入量的增大，酶活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)加入量為葉量2倍時(shí)，酶活性達(dá)到最高。緩沖液pH值對(duì)酶活性也有較大影響。隨著pH值的增大，酶活性先增后減，在pH8.0-pH8.8時(shí)，活性增加緩慢，pH8.8時(shí)酶活性達(dá)到最大值。酶促反應(yīng)以55℃為宜，在此條件下反應(yīng)120分鐘內(nèi)酶活性穩(wěn)

3、定性較好。據(jù)此，PAL提取條件為：加入2倍鮮葉量的PVP，以pH8.8的硼酸-硼砂作為提取緩沖液；PAL活性分析條件為：酶促反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為120分鐘內(nèi)。 2.藤茶PAL的分離純化。 采用硫酸銨分級(jí)沉淀法和DEAE-纖維素柱層析法對(duì)藤茶葉PAL進(jìn)行分離純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)得到一條單一蛋白的弱帶，該酶的純化倍數(shù)提高了8.6倍，得率為6.8％，酶比活為11.8U*102mg-1。 3.藤茶PA

4、L酶學(xué)性質(zhì)研究。 PAL酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶最適pH為8.8，在pH8.0-pH9.0間比較穩(wěn)定，酶活性在90％以上。最適溫度為55℃，熱穩(wěn)定范圍在30℃-60℃之間。在4℃和甘油條件下貯藏兩周，酶活性仍在60％。最適底物濃度為0.02mol/L。PAL可能是由35KD的4個(gè)亞基組成；對(duì)底物的米氏常數(shù)：Km1=1.9×10-2，Km2=0.966×10-3。重金屬SrCl2、AgNO3都能不同程度地抑制酶活性；金屬離子MgCl

5、2，CaCl2、ZnSO4對(duì)藤茶PAL有不同程度的抑制作用，而FeSO4，CuSO4，MnCl2(2mmol/L)均促進(jìn)酶活性；0.5mmol/LEDTA抑制酶活性，而在1mmol/L-4mmol/L范圍內(nèi)對(duì)酶活表現(xiàn)為一定的促進(jìn)作用，SDS對(duì)酶活表現(xiàn)出很強(qiáng)抑制作用。 4.藤茶不同時(shí)期和部位PAL活性與黃酮和DMY含量變化的相關(guān)性分析。 PAL活性與黃酮，DMY含量變化在年生長(zhǎng)周期內(nèi)整體上成負(fù)相關(guān)性，但是在不同時(shí)期和不同部