谷子抗銹基因RLr1的AFLP標(biāo)記和抗銹相關(guān)基因片段的克隆.pdf

1、谷子銹病是嚴(yán)重影響谷子產(chǎn)量的主要病害之一，當(dāng)前培育和利用谷子抗銹品種仍然是控制其危害的一種經(jīng)濟(jì)有效措施。尋找與抗銹基因緊密連鎖或連鎖的分子標(biāo)記和克隆抗銹基因，對(duì)于抗谷子銹病基因的分離和利用具有重要意義。 本研究對(duì)高抗銹病親本十里香和高感病親本豫谷l號(hào)及其F1、F2代分離群體進(jìn)行接種鑒定和AFLP標(biāo)記。同時(shí)，根據(jù)已知植物抗銹基因并結(jié)合抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增谷子基因組中的抗銹基因同源序列，并利用Genomic Walking技

2、術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增延伸。主要取得以下結(jié)果: 1.對(duì)高抗親本十里香、高感親本豫谷1號(hào)、親本雜交Fl代、Fl代自交F2代群體進(jìn)行抗銹性接種鑒定，調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):十里香和Fl代全表現(xiàn)抗病，豫谷1 號(hào)表現(xiàn)感病，F(xiàn)2代表現(xiàn)明顯出現(xiàn)抗感分離?？垢蟹蛛x的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:F2代群體抗感分離比例符合3:l。因此說明，十里香的抗銹性受顯性單基因控制，該抗銹基因暫命名為RLrl。 2.采用限制性內(nèi)切酶Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切谷子基因組

3、DNA銀染檢測(cè)的方法，對(duì)谷子F2代分離群體進(jìn)行AFLP分析。隨機(jī)選擇102對(duì)AFLP引物組合對(duì)F2分離群體的抗銹基因池和感銹基因池進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有33對(duì)引物組合能揭示兩親本間的多態(tài)性。 3.對(duì)篩選出的33對(duì)引物組合利用F2代單株進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn):引物組合E-CTT/M-ACA和E-CTT/M-TAC能夠在親本和F2代分離群體間穩(wěn)定擴(kuò)增出特異多態(tài)性條帶。引物組合E-CTT/M-ACA在母本豫谷1號(hào)和感銹植株中擴(kuò)增出分子量

4、為180 bp的特異條帶(E1)，而父本和抗銹植株中沒有擴(kuò)增出此條帶；引物組合E-CTT/M-TAC能夠在父本十里香和抗銹植株中擴(kuò)增出分子量為256 bp的特異條帶(E2)，而母本和感銹植株中沒有擴(kuò)增出此條帶。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后經(jīng)MapMaker 3.0軟件分析，結(jié)果分子標(biāo)記E1與抗銹基因無連鎖；分子標(biāo)記E2與抗銹病基因RLrl連鎖，遺傳距離是7.4 eM。將所得特異條帶回收、克隆和測(cè)序。通過網(wǎng)上同源性比對(duì)，E2與轉(zhuǎn)位蛋白亞基SecY有62％的

5、同源性。該蛋白調(diào)控分泌蛋白在細(xì)胞膜上的運(yùn)輸。 4.根據(jù)已知抗銹基因結(jié)合抗病基因核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)、富含亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeats LRR)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，以豫谷1號(hào)為對(duì)照從谷子cDNA中擴(kuò)增出2個(gè)抗銹基因同源片段，分別為1 420bp和686bp。然后結(jié)合Genomic walking技術(shù)將2片段分別延長(zhǎng)到3 120 bp和1 527 bp。2個(gè)