玉米轉(zhuǎn)錄因子Opaque2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與19-kDaα-醇溶蛋白基因的DNA甲基化研究.pdf

1、玉米（maize，Zea mays）是世界上最重要的糧食作物之一，玉米的籽粒是營養(yǎng)儲藏的重要器官，在種子總蛋白中，種子儲藏蛋白(seed storage proteins，SSP)約占總蛋白含量的70％，其中的醇溶蛋白又是玉米種子儲藏蛋白中最重要的蛋白，約占70％。然而由于醇溶蛋白特別是α-醇溶蛋白的必需氨基酸含量較低，影響了玉米的營養(yǎng)價值。而轉(zhuǎn)錄因子Opaque2(O2)能結(jié)合22-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動子上的TCCACGTAG

2、A模體序列調(diào)控其表達(dá)，O2基因的突變能降低α-醇溶蛋白的含量，提高含必需氨基酸蛋白的含量，從而提高玉米的營養(yǎng)價值。此外，O2還能通過結(jié)合核糖體失活蛋白（Ribosome-Inactivating Proteins，RIP）基因啟動子上的GATGAPyPuTGPu模體調(diào)控其表達(dá)。本研究利用生物信息學(xué)的方法，在玉米全基因組范圍內(nèi)搜索潛在的O2所調(diào)控基因;結(jié)合雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)，分析W64A及其O2突變體W64Ao2的差異蛋白，尋找O2基因所

3、調(diào)控的蛋白;并對19-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動子及其本體的DNA甲基化進(jìn)行分析，探究19-kDa和22-kDa的α-醇溶蛋白基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，主要研究結(jié)果如下:
　　1、在玉米全基因組范圍內(nèi)搜索到31個啟動子上含TCCACGTAGA模體的基因，其中有8個是串聯(lián)重復(fù)的22-kDa的α-醇溶蛋白基因。GO分析顯示這8個α-醇溶蛋白基因參與營養(yǎng)儲藏功能，其他基因主要是參與催化活性的酶類編碼基因。而含有GATGAPyPuTGPu模體

4、序列的基因有683個，其中197個基因有功能注釋，GO分析顯示這些基因參與最多的是結(jié)合、催化活性和細(xì)胞組分，并且多數(shù)參與核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類等物質(zhì)的代謝催化反應(yīng)，另外還有部分轉(zhuǎn)錄因子。組織表達(dá)分析顯示共有12個基因在胚乳中特異性表達(dá)，其中8個是22-kDa的α-醇溶蛋白基因，另外4個是含有GATGAPyPuTGPu模體序列的基因，其中包括直接受O2調(diào)控的RIP基因。
　　2、通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)共鑒定到W64A及其O2突變

5、體間的19個差異蛋白，GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是參與催化和代謝相關(guān)酶類，以及參與細(xì)胞組成和應(yīng)激相關(guān)。組織表達(dá)分析表明6個為種子中特異性高表達(dá)的蛋白，分別是與種子儲藏相關(guān)的蛋白、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)和直接受O2基因調(diào)控的RIP蛋白。通過RT-PCR實驗檢測，發(fā)現(xiàn)有5個基因在野生型與突變體中的轉(zhuǎn)錄水平差異較大。
　　3、對19-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動子的DNA甲基化分

6、析發(fā)現(xiàn)啟動子的高甲基化能抑制醇溶蛋白基因的表達(dá)，而組織培養(yǎng)能改變基因啟動子上的DNA甲基化狀態(tài)，從而改變基因的表達(dá)水平，而且組織培養(yǎng)對不同基因的DNA甲基化的影響不同，既能降低又能升高DNA甲基化水平。在z1B基因中，z1B1的啟動子DNA甲基化水平降低而使其表達(dá)水平顯著上升，而z1B4和z1B6的啟動子DNA甲基化水平升高而使其表達(dá)水平顯著下降。但z1A基因啟動子DNA甲基化的變化對基因的表達(dá)幾乎沒有影響，表現(xiàn)出位點特異性。相比啟動子