轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)甲基化檢測(cè)及其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)的研究.pdf

1、甲基化是最常見(jiàn)的DNA表觀遺傳修飾，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前檢測(cè)DNA甲基化的方法各種各樣，但絕大多數(shù)程序繁瑣，且不能將甲基化檢測(cè)結(jié)果與其基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)聯(lián)系起來(lái)，難以用于基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的研究。因此，建立一種簡(jiǎn)單而高效的可同步檢測(cè)DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的新技術(shù)非常必要。
　　 本論文研究的目的是基于我們實(shí)驗(yàn)室多年研究的雙鏈DNA微陣列(dsDNA microarray)技術(shù)，建立一種可同步高通量檢

2、測(cè)基因調(diào)控區(qū)，特別是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的新方法。該方法的基本方案是：設(shè)計(jì)針對(duì)某一轉(zhuǎn)錄因子靶基因調(diào)控區(qū)TFBS的寡核苷酸探針，將其共價(jià)交聯(lián)固定在96微孔板孔內(nèi)，制備出檢測(cè)基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控效應(yīng)的ssDNA微孔板(ssDNA-Plate)；提取待檢測(cè)組織或細(xì)胞的基因組DNA，超聲打斷，與ssDNA-Plate雜交，形成dsDNA-Plate；將雜交形成的dsDNA微孔板分為兩

3、半：一半與抗甲基胞嘧啶抗體反應(yīng)，再與相應(yīng)的綠色熒光標(biāo)記二抗反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA正負(fù)鏈上甲基化的檢測(cè)；另一組與轉(zhuǎn)錄因子蛋白反應(yīng)，再與轉(zhuǎn)錄因子一抗反應(yīng)，最后與紅色熒光標(biāo)記二抗反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TFBS結(jié)合的檢測(cè)。
　　 研究中以典型轉(zhuǎn)錄因子E2F為例，設(shè)計(jì)了檢測(cè)4個(gè)腫瘤相關(guān)基因(TP53BP2、ARF、Apaf-1、KIR3DL1)調(diào)控區(qū)13個(gè)E2F結(jié)合位點(diǎn)(E2F-BSs)正負(fù)鏈DNA甲基化的寡核苷酸探針，制備成E2F靶基因E2F

4、-BSs甲基化及其E2F結(jié)合調(diào)控效應(yīng)的ssDNA微孔板。用該微孔板檢測(cè)了這些E2F-BSs在3種腫瘤細(xì)胞(LOVO、HepG2、K562)和成纖維細(xì)胞(HFL-1)中的甲基化及其E2F結(jié)合。結(jié)果表明，該微孔板能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出這些E2F-BSs在所檢細(xì)胞中的甲基化，檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道及本論文對(duì)個(gè)別位點(diǎn)的亞硫酸氫鹽處理DNA測(cè)序抽檢結(jié)果完全一致，說(shuō)明本論文設(shè)計(jì)的方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化。
　　 轉(zhuǎn)錄因子E2F對(duì)13個(gè)結(jié)合

5、位點(diǎn)的結(jié)合檢測(cè)結(jié)果表明，E2F結(jié)合位點(diǎn)上的甲基化能夠定量化干擾E2F的結(jié)合，但不同鏈上的甲基化對(duì)E2F結(jié)合的干擾效果截然不同。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)位于E2F結(jié)合鏈上的甲基化能夠顯著抑制E2F結(jié)合，而位于DP結(jié)合鏈上的甲基化對(duì)E2F結(jié)合幾乎無(wú)影響。甲基化對(duì)E2F結(jié)合的干擾與E2F靶基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，可見(jiàn)甲基化通過(guò)抑制E2F結(jié)合而抑制E2F靶基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果說(shuō)明，本論文設(shè)計(jì)的方法可檢測(cè)出基因調(diào)控區(qū)甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的調(diào)控作