DNA甲基化修飾與內(nèi)源性miRNA對珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、珠蛋白基因簇在個體發(fā)育中表現(xiàn)為依次表達(dá),并具有高度的組織特異性和發(fā)育階段特異性。珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄受染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、編碼基因與其旁側(cè)序列甲基化程度、順式調(diào)節(jié)元件及細(xì)胞內(nèi)反式作用因子的調(diào)節(jié)控制。Locus control regiongs(LCRs,基因座控制區(qū))在功能上被定義為一類發(fā)育中的哺乳動物紅細(xì)胞α珠蛋白和β珠蛋白基因表達(dá)所必需的上游調(diào)控序列。LCR可提高與其相銜接的基因的表達(dá)并具有組織特異型和拷貝數(shù)依賴的功能元件,是最重要調(diào)節(jié)珠蛋白基

2、因表達(dá)的一類順式作用元件。有關(guān)珠蛋白基因組織特異性表達(dá)的各種研究和理論模型中,都暗示了珠蛋白表觀遺傳修飾在調(diào)控珠蛋白基因的特異性表達(dá)中的重要功能。由于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以往有關(guān)組蛋白修飾與珠蛋白基因表達(dá)關(guān)心的研究大多在細(xì)胞系中進(jìn)行,因而無法重現(xiàn)珠蛋白基因的組織特異性表達(dá)。
　　 本論文利用先前構(gòu)建的由LCR的HS3-2元件和β-珠蛋白基因啟動子驅(qū)動表達(dá)EGFP報告基因的小鼠模型,對DNA的差異性甲基化修飾和內(nèi)源性的miRNA在

3、珠蛋白基因的特異性表達(dá)中的作用進(jìn)行了研究。首先我們運(yùn)用定量RT-PCR的技術(shù)檢測了報告基因在不同組織中的表達(dá)水平;在該模型小鼠呈現(xiàn)良好的組織特異性表達(dá)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用DNA亞硫酸鹽修飾的方法,測定了人LCR和β-珠蛋白啟動子區(qū)域在轉(zhuǎn)基因小鼠各組織中的甲基化水平差異,以揭示DNA的甲基化修飾在組織特異性表達(dá)中的作用。這部分工作獲得的主要進(jìn)展是:1.以人珠蛋白基因的LCR和啟動子驅(qū)動表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠在紅系組織中高效表達(dá)人珠蛋白基因,是

4、在活體水平研究珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控的良好模型;2.運(yùn)用亞硫酸鹽測序的方法,對轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中珠蛋白基因的LCR和啟動子區(qū)的CpG的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測和比較。結(jié)果證實(shí),對應(yīng)的CpG位點(diǎn)在6種紅系組織和非紅系組織中的甲基化程度和模式有顯著差異。對于區(qū)域的甲基化程度,紅系組織中較非紅系組織中低,而這種較低的甲基化修飾與報告基因EGFP的活躍轉(zhuǎn)錄對應(yīng);3.運(yùn)用定量RT-PCR技術(shù),對三種DNA甲基化酶在轉(zhuǎn)基因小鼠各組織內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了比較分析

5、。結(jié)果顯示,“起始性”(de novo)的Dnmt3a和Dnmt3b在紅系組織和非紅系組織中的表達(dá)模式有顯著差異,而“維持性”(maintenance)的甲基化酶Dnmt1的表達(dá)則沒有明顯的紅系特異性。這不僅是DNA甲基化修飾影響珠蛋白基因的表達(dá)的直接證據(jù),也說明珠蛋白基因的甲基化修飾是Dnmt3a和Dnmt3b作用的結(jié)果;4珠蛋白基因的啟動子甲基化存在偏愛性,有若干個甲基化化敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)區(qū)域。表觀遺傳修飾可能

6、是作用于轉(zhuǎn)錄因子和DNA的結(jié)合來調(diào)節(jié)珠蛋白基因的表達(dá)。
　　 為了探討轉(zhuǎn)基因小鼠報告基因EGFP組織特異性表達(dá)是否與內(nèi)源性miRNA的功能相關(guān),本研究對靶向作用于人珠蛋白基因的內(nèi)源性的miRNA進(jìn)行了初步研究。應(yīng)用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法,找到了針對珠蛋白基因3’UTR區(qū)的25個小鼠內(nèi)源性miRNA,并對其中5個miRNA進(jìn)行了較深入的分析。結(jié)果顯示,miR-34c和miR-379與組織中EGFP mRNA及Dnmt3a和Dn