動(dòng)脈粥樣硬化病變分子機(jī)制和基因治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.背景： 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定所導(dǎo)致的斑塊破裂和血栓形成是引起急性心腦血管事件的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)典型的易損斑塊具有以下特點(diǎn)：較大的脂核、較薄的纖維帽、斑塊膠原纖維和平滑肌細(xì)胞含量減少、巨噬細(xì)胞密度和活性增加、活化T細(xì)胞浸潤(rùn)增加等，其中斑塊膠原的過(guò)度降解是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的主要原因，因此斑塊內(nèi)膠原的代謝平衡已成為近年來(lái)心血管病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽的完整性和高強(qiáng)度主要有賴于細(xì)胞外基質(zhì)的支持，其中最

2、主要的成分是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原纖維。膠原代謝主要由膠原的合成與降解平衡來(lái)調(diào)節(jié)。此外，膠原纖維的三維結(jié)構(gòu)也是影響其功能的因素之一。分布在動(dòng)脈內(nèi)膜的血管平滑肌細(xì)胞是粥樣斑塊內(nèi)膠原的主要來(lái)源。斑塊內(nèi)膠原的代謝失調(diào)如膠原合成減少和/或降解增加均可導(dǎo)致斑塊表面的纖維帽變薄和斑塊的不穩(wěn)定。因此，明確斑塊的細(xì)胞外基質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于穩(wěn)定斑塊具有重要的意義。 膠原蛋白的生物學(xué)合成過(guò)程包括一系列的前骨膠原的翻譯后修飾，其中細(xì)胞修飾過(guò)程需要5

3、種酶的參與，包括3種膠原羥化酶和2種膠原糖基轉(zhuǎn)移酶。在這些羥化酶中，4羥基-脯氨酸羥化酶（P4H）是一個(gè)具有2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基的四聚體。其中β亞基是二硫化異構(gòu)酶，起催化作用的主要部位存在于β亞基，而α亞基的主要作用是決定酶的活性，是膠原合成的重要限速酶。P4H是在所有的已知21種類型膠原合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶。P4H的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致膠原的合成增多，而抑制P4H的產(chǎn)生則可導(dǎo)致膠原的不穩(wěn)定和降解。 炎癥在許多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)

4、展過(guò)程中都起著重要的作用，如動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌病和動(dòng)脈瘤等。在急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)病過(guò)程中，炎癥是斑塊易損和破裂的始動(dòng)環(huán)節(jié)。炎癥可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子以及各種白細(xì)胞介素等，這些細(xì)胞因子可通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶和抑制膠原合成引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解。在這些因子中，TNFα由激活的巨噬細(xì)胞所分泌，在細(xì)胞外基質(zhì)降解和ACS的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。 2.目的： （1）在體外試驗(yàn)中

5、，研究腫瘤壞死因子對(duì)膠原酶限速亞單位P4Hα1的抑制作用。 （2）在體外試驗(yàn)中，探討TNFα對(duì)P4Hα1抑制作用的分子機(jī)制，為穩(wěn)定易損斑塊尋找新的治療靶點(diǎn)。 3.方法： 3.1質(zhì)粒構(gòu)建 pGL3-baisc多克隆載體被用來(lái)構(gòu)建包含P4Hα1啟動(dòng)子片斷的質(zhì)粒。我們首先應(yīng)用帶有KpnⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶雙酶切位點(diǎn)，并含有P4Hα1啟動(dòng)子片斷的引物對(duì)P4Hα1啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增。我們選取了-580bp至+76bp

6、這一部分的啟動(dòng)子序列，采用逐段刪除的方法，對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，最后得到了包含9段P4Hα1啟動(dòng)子片斷，順序依次為：-580至+76bp、-480至+76bp、-417至+76bp、-320至+76bp、-271至+76bp、-184至+76bp、-145至+76bp、-97至+76bp、-32至+76bp、+18至+76bp的pGL3-P4Hα1載體。 3.2對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與刺激 在劑量實(shí)驗(yàn)中，0 ng/ml，1 ng/ml，

7、10 ng/ml和100 ng/ml TNFα純品被分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，在時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?小時(shí)，8小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)，分別向培養(yǎng)基中加入100 ng/ml TNFα，與培養(yǎng)基充分混勻后進(jìn)行檢測(cè)。將1 ug含有P4Hα1啟動(dòng)子片斷的pGL3-baisc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)平滑肌細(xì)胞中，進(jìn)行下一步檢測(cè)。為了檢測(cè)細(xì)胞因子在TNFα對(duì)P4Hα1抑制過(guò)程中所起的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了因子NonO、hnRNP-K、BUB3、ILF2、DJ-1和HIF

8、1等的RNA干擾片斷，將siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。 3.3 RT-PCR 通過(guò)RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR的方法對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)P4Hα1，β-actin，luciferase等的mRNA進(jìn)行檢測(cè)。 3.4 EMSA 將探針與細(xì)胞核蛋白混合，用抗體標(biāo)記后進(jìn)行凝膠電泳，觀察探針與蛋白的結(jié)合能力。 3.5 ChIP分析 將抗目的蛋白的抗體與核蛋白結(jié)合后，用含有目的片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

9、，觀察目的蛋白與目的DNA片段的結(jié)合能力。 3.6 Western Blot 經(jīng)過(guò)提取蛋白，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，標(biāo)記一抗和二抗，曝光等步驟觀察目的蛋白的表達(dá)。 4.結(jié)果： 4.1.TNFα對(duì)P4Hα1的抑制作用 我們用100ng/ml TNFα分別刺激平滑肌細(xì)胞4，8，24和48小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)P4Hα1mRNA的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)經(jīng)TNFα刺激8小時(shí)后，P4Hα1mRNA產(chǎn)量明顯下降。用1n

10、g/ml，10ng/ml和100ng/ml TNFα刺激平滑肌細(xì)胞8小時(shí)，觀測(cè)P4Hα1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著TNFα濃度的升高，P4Hα1的mRNA水平呈遞減趨勢(shì)，在100ng/ml達(dá)到最大的抑制效應(yīng)。 4.2.P4Hα1啟動(dòng)子上TNFα反應(yīng)元件的鑒定 我們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將含有P4Hα1啟動(dòng)子片斷的PGL3 Basic載體轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞中，經(jīng)TNFα刺激后，用RT-PCR的方法檢測(cè)PGL3 Basic載體上熒光

11、素酶的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了含有+18至+76bp啟動(dòng)子片斷的載體后，超過(guò)80％的TNFα的抑制作用消失，熒光素酶表達(dá)基本恢復(fù)正常，證明TNFα反應(yīng)元件位于P4Hα1啟動(dòng)子-32至+18片斷上，TNFα通過(guò)作用于這一片斷抑制P4Hα1的mRNA表達(dá)。 4.3.NonO與P4Hα1啟動(dòng)子的結(jié)合 在EMSA中，我們將平滑肌細(xì)胞核蛋白與含有-32至+18片斷的探針結(jié)合后，用抗NonO抗體標(biāo)記，在經(jīng)TNFα1刺激后，Supershif

12、t條帶顯著增強(qiáng)，證明NonO在TNFα刺激后，與P4Hα1啟動(dòng)子的結(jié)合力增強(qiáng)。在平滑肌細(xì)胞核蛋白中，用抗NonO抗體免疫共沉淀下與NonO結(jié)合的DNA片段，用包含P4Hα1啟動(dòng)子-32至+18片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)只有經(jīng)TNFα刺激后，NonO蛋白才能與P4Hα1啟動(dòng)子結(jié)合，從而擴(kuò)增出清晰的PCR條帶。將NonOsiRNA轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞后，經(jīng)TNFα1刺激，用RT-PCR檢測(cè)P4Hα1mRNA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)敲低NonO蛋白后，6

13、0％以上的TNFα對(duì)P4Hα1mRNA的抑制作用消失。 4.4.TNFα通過(guò)下游通路ASK1和JNK實(shí)現(xiàn)對(duì)P4Hα1的抑制作用 TNFα刺激平滑肌細(xì)胞前，先用JNK抑制劑-SP600125刺激平滑肌細(xì)胞1小時(shí)阻斷JNK通路，觀測(cè)P4Hα1 mRNA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)加入JNK抑制劑后，TNFα對(duì)P4Hα1 mRNA的抑制作用基本消失。ASK1抑制劑-Thioredoxin刺激平滑肌細(xì)胞1小時(shí)后，繼續(xù)用TNFα刺激8小時(shí)，RT

14、-PCR檢測(cè)P4Hα1的mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)ASK1抑制劑幾乎全部消除了TNFα對(duì)P4Hα1mRNA的抑制作用。 4.5.DJ-1在TNFα對(duì)P4Hα1抑制過(guò)程中的作用 我們將DJ-1 siRNA轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞中沉默DJ-1基因，經(jīng)TNFα刺激后，觀察P4Hα1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示DJ-1基因沉默消除了超過(guò)50％的TNFα對(duì)P4Hα1的抑制作用。將DJ-1 siRNA轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞中，并分別用TNFα和JNK1腺

15、病毒刺激細(xì)胞，用抗NonO抗體免疫共沉淀后用含有P4Hα1啟動(dòng)子TaRE片段的引物PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)經(jīng)TNFα或JNK1刺激都不能擴(kuò)增出PCR片段，證明DJ-1 RNA干擾后， NonO與TaRE不再結(jié)合。我們進(jìn)一步將NonOsiRNA轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞，用TNFα或JNK1腺病毒刺激后，用抗DJ-1抗體進(jìn)行ChIP分析，發(fā)現(xiàn)不僅將NonO敲低后，DJ-1不能與TaRE結(jié)合，而且在沒有轉(zhuǎn)染NonOsiRNA的細(xì)胞中，TNFα或JNK1也都不能

16、導(dǎo)致DJ-1與TaRE的結(jié)合。進(jìn)一步用抗氧化DJ-1抗體進(jìn)行ChIP分析，發(fā)現(xiàn)TNFα和JNK1均可使氧化DJ-1與TaRE結(jié)合，在將NonO基因沉默后，這種結(jié)合力明顯下降。 4.6.TNFα導(dǎo)致的組蛋白改變 平滑肌細(xì)胞經(jīng)TNFα或JNK1腺病毒刺激后，提取核蛋白，用抗組蛋白4第12個(gè)賴氨酸的抗體進(jìn)行ChIP分析。結(jié)果顯示，經(jīng)TNFα刺激后，組蛋白4第12個(gè)賴氨酸的乙?；黠@增強(qiáng)。平滑肌細(xì)胞經(jīng)TNFα或JNK1腺病毒刺激

17、后，用抗組蛋白3第9個(gè)賴氨酸的抗體和包含P4Hα1啟動(dòng)子TaRE片段的引物進(jìn)行ChIP分析。發(fā)現(xiàn)TNFα刺激后，組蛋白3第9個(gè)賴氨酸的去乙?；黠@增強(qiáng)。用20uMHATI刺激平滑肌細(xì)胞24小時(shí)，提取核蛋白，用抗NonO抗體進(jìn)行ChIP分析后發(fā)現(xiàn)，不能擴(kuò)增出PCR片段，證明經(jīng)HATI刺激后，NonO不能再與P4Hα1啟動(dòng)子片段結(jié)合。經(jīng)TSA刺激后，用抗NonO抗體免疫共沉淀NonO蛋白后，經(jīng)ChIP分析，發(fā)現(xiàn)TSA對(duì)NonO與TaRE片段