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文檔簡介
1、1.背景: 動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定所導致的斑塊破裂和血栓形成是引起急性心腦血管事件的主要原因。研究發(fā)現典型的易損斑塊具有以下特點:較大的脂核、較薄的纖維帽、斑塊膠原纖維和平滑肌細胞含量減少、巨噬細胞密度和活性增加、活化T細胞浸潤增加等,其中斑塊膠原的過度降解是導致斑塊不穩(wěn)定的主要原因,因此斑塊內膠原的代謝平衡已成為近年來心血管病基礎研究的熱點之一。 動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的完整性和高強度主要有賴于細胞外基質的支持,其中最
2、主要的成分是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原纖維。膠原代謝主要由膠原的合成與降解平衡來調節(jié)。此外,膠原纖維的三維結構也是影響其功能的因素之一。分布在動脈內膜的血管平滑肌細胞是粥樣斑塊內膠原的主要來源。斑塊內膠原的代謝失調如膠原合成減少和/或降解增加均可導致斑塊表面的纖維帽變薄和斑塊的不穩(wěn)定。因此,明確斑塊的細胞外基質代謝及其調節(jié)機制對于穩(wěn)定斑塊具有重要的意義。 膠原蛋白的生物學合成過程包括一系列的前骨膠原的翻譯后修飾,其中細胞修飾過程需要5
3、種酶的參與,包括3種膠原羥化酶和2種膠原糖基轉移酶。在這些羥化酶中,4羥基-脯氨酸羥化酶(P4H)是一個具有2個α亞基和2個β亞基的四聚體。其中β亞基是二硫化異構酶,起催化作用的主要部位存在于β亞基,而α亞基的主要作用是決定酶的活性,是膠原合成的重要限速酶。P4H是在所有的已知21種類型膠原合成過程中起關鍵作用的酶。P4H的過表達會導致膠原的合成增多,而抑制P4H的產生則可導致膠原的不穩(wěn)定和降解。 炎癥在許多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)
4、展過程中都起著重要的作用,如動脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌病和動脈瘤等。在急性冠狀動脈綜合征的發(fā)病過程中,炎癥是斑塊易損和破裂的始動環(huán)節(jié)。炎癥可以誘導多種細胞因子的分泌,如腫瘤壞死因子、轉錄生長因子以及各種白細胞介素等,這些細胞因子可通過激活基質金屬蛋白酶和抑制膠原合成引起細胞外基質的降解。在這些因子中,TNFα由激活的巨噬細胞所分泌,在細胞外基質降解和ACS的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。 2.目的: (1)在體外試驗中
5、,研究腫瘤壞死因子對膠原酶限速亞單位P4Hα1的抑制作用。 (2)在體外試驗中,探討TNFα對P4Hα1抑制作用的分子機制,為穩(wěn)定易損斑塊尋找新的治療靶點。 3.方法: 3.1質粒構建 pGL3-baisc多克隆載體被用來構建包含P4Hα1啟動子片斷的質粒。我們首先應用帶有KpnⅠ和HindⅢ內切酶雙酶切位點,并含有P4Hα1啟動子片斷的引物對P4Hα1啟動子進行擴增。我們選取了-580bp至+76bp
6、這一部分的啟動子序列,采用逐段刪除的方法,對引物進行設計,最后得到了包含9段P4Hα1啟動子片斷,順序依次為:-580至+76bp、-480至+76bp、-417至+76bp、-320至+76bp、-271至+76bp、-184至+76bp、-145至+76bp、-97至+76bp、-32至+76bp、+18至+76bp的pGL3-P4Hα1載體。 3.2對細胞的轉染與刺激 在劑量實驗中,0 ng/ml,1 ng/ml,
7、10 ng/ml和100 ng/ml TNFα純品被分別加入到細胞培養(yǎng)基中,在時間實驗中,我們在4小時,8小時,24小時和48小時,分別向培養(yǎng)基中加入100 ng/ml TNFα,與培養(yǎng)基充分混勻后進行檢測。將1 ug含有P4Hα1啟動子片斷的pGL3-baisc質粒轉染進平滑肌細胞中,進行下一步檢測。為了檢測細胞因子在TNFα對P4Hα1抑制過程中所起的作用,我們設計了因子NonO、hnRNP-K、BUB3、ILF2、DJ-1和HIF
8、1等的RNA干擾片斷,將siRNA轉染入細胞進行檢測。 3.3 RT-PCR 通過RNA提取,逆轉錄和RT-PCR的方法對平滑肌細胞內P4Hα1,β-actin,luciferase等的mRNA進行檢測。 3.4 EMSA 將探針與細胞核蛋白混合,用抗體標記后進行凝膠電泳,觀察探針與蛋白的結合能力。 3.5 ChIP分析 將抗目的蛋白的抗體與核蛋白結合后,用含有目的片段的引物進行PCR擴增
9、,觀察目的蛋白與目的DNA片段的結合能力。 3.6 Western Blot 經過提取蛋白,凝膠電泳,轉膜,標記一抗和二抗,曝光等步驟觀察目的蛋白的表達。 4.結果: 4.1.TNFα對P4Hα1的抑制作用 我們用100ng/ml TNFα分別刺激平滑肌細胞4,8,24和48小時后,提取細胞RNA,檢測P4Hα1mRNA的表達水平。發(fā)現經TNFα刺激8小時后,P4Hα1mRNA產量明顯下降。用1n
10、g/ml,10ng/ml和100ng/ml TNFα刺激平滑肌細胞8小時,觀測P4Hα1 mRNA的表達,發(fā)現隨著TNFα濃度的升高,P4Hα1的mRNA水平呈遞減趨勢,在100ng/ml達到最大的抑制效應。 4.2.P4Hα1啟動子上TNFα反應元件的鑒定 我們用脂質體轉染的方式將含有P4Hα1啟動子片斷的PGL3 Basic載體轉入平滑肌細胞中,經TNFα刺激后,用RT-PCR的方法檢測PGL3 Basic載體上熒光
11、素酶的表達。發(fā)現轉染了含有+18至+76bp啟動子片斷的載體后,超過80%的TNFα的抑制作用消失,熒光素酶表達基本恢復正常,證明TNFα反應元件位于P4Hα1啟動子-32至+18片斷上,TNFα通過作用于這一片斷抑制P4Hα1的mRNA表達。 4.3.NonO與P4Hα1啟動子的結合 在EMSA中,我們將平滑肌細胞核蛋白與含有-32至+18片斷的探針結合后,用抗NonO抗體標記,在經TNFα1刺激后,Supershif
12、t條帶顯著增強,證明NonO在TNFα刺激后,與P4Hα1啟動子的結合力增強。在平滑肌細胞核蛋白中,用抗NonO抗體免疫共沉淀下與NonO結合的DNA片段,用包含P4Hα1啟動子-32至+18片斷的引物進行PCR擴增后,發(fā)現只有經TNFα刺激后,NonO蛋白才能與P4Hα1啟動子結合,從而擴增出清晰的PCR條帶。將NonOsiRNA轉入平滑肌細胞后,經TNFα1刺激,用RT-PCR檢測P4Hα1mRNA的表達。發(fā)現敲低NonO蛋白后,6
13、0%以上的TNFα對P4Hα1mRNA的抑制作用消失。 4.4.TNFα通過下游通路ASK1和JNK實現對P4Hα1的抑制作用 TNFα刺激平滑肌細胞前,先用JNK抑制劑-SP600125刺激平滑肌細胞1小時阻斷JNK通路,觀測P4Hα1 mRNA的表達。發(fā)現加入JNK抑制劑后,TNFα對P4Hα1 mRNA的抑制作用基本消失。ASK1抑制劑-Thioredoxin刺激平滑肌細胞1小時后,繼續(xù)用TNFα刺激8小時,RT
14、-PCR檢測P4Hα1的mRNA水平變化,發(fā)現ASK1抑制劑幾乎全部消除了TNFα對P4Hα1mRNA的抑制作用。 4.5.DJ-1在TNFα對P4Hα1抑制過程中的作用 我們將DJ-1 siRNA轉入平滑肌細胞中沉默DJ-1基因,經TNFα刺激后,觀察P4Hα1 mRNA的表達。結果顯示DJ-1基因沉默消除了超過50%的TNFα對P4Hα1的抑制作用。將DJ-1 siRNA轉入平滑肌細胞中,并分別用TNFα和JNK1腺
15、病毒刺激細胞,用抗NonO抗體免疫共沉淀后用含有P4Hα1啟動子TaRE片段的引物PCR擴增,發(fā)現經TNFα或JNK1刺激都不能擴增出PCR片段,證明DJ-1 RNA干擾后, NonO與TaRE不再結合。我們進一步將NonOsiRNA轉入平滑肌細胞,用TNFα或JNK1腺病毒刺激后,用抗DJ-1抗體進行ChIP分析,發(fā)現不僅將NonO敲低后,DJ-1不能與TaRE結合,而且在沒有轉染NonOsiRNA的細胞中,TNFα或JNK1也都不能
16、導致DJ-1與TaRE的結合。進一步用抗氧化DJ-1抗體進行ChIP分析,發(fā)現TNFα和JNK1均可使氧化DJ-1與TaRE結合,在將NonO基因沉默后,這種結合力明顯下降。 4.6.TNFα導致的組蛋白改變 平滑肌細胞經TNFα或JNK1腺病毒刺激后,提取核蛋白,用抗組蛋白4第12個賴氨酸的抗體進行ChIP分析。結果顯示,經TNFα刺激后,組蛋白4第12個賴氨酸的乙?;黠@增強。平滑肌細胞經TNFα或JNK1腺病毒刺激
17、后,用抗組蛋白3第9個賴氨酸的抗體和包含P4Hα1啟動子TaRE片段的引物進行ChIP分析。發(fā)現TNFα刺激后,組蛋白3第9個賴氨酸的去乙?;黠@增強。用20uMHATI刺激平滑肌細胞24小時,提取核蛋白,用抗NonO抗體進行ChIP分析后發(fā)現,不能擴增出PCR片段,證明經HATI刺激后,NonO不能再與P4Hα1啟動子片段結合。經TSA刺激后,用抗NonO抗體免疫共沉淀NonO蛋白后,經ChIP分析,發(fā)現TSA對NonO與TaRE片段
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