長期EECP的抗動脈粥樣硬化作用及分子機制的實驗研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)被公認為一種具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程。血管內(nèi)皮細胞功能損傷被認為是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)。作為動脈粥樣硬化病變獨立的危險因素，高膽固醇血癥促進脂質(zhì)的過氧化，所形成的氧化修飾低密度脂蛋白(OX-LDL)為內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵成分。 增強型體外反搏(EnhancedexternalcounterpulsationEECP)作為一種無創(chuàng)的體外輔助循環(huán)裝置，它為動脈粥樣硬化性心血管

2、病人尤其是那些不適合冠脈血運重建手術(shù)或傳統(tǒng)藥物療效欠佳的病人提供了一項有效的治療措施。 研究目的： 1.通過高膽固醇喂飼實驗豬建立高脂血癥及早期動脈粥樣硬化動物模型。 2.設(shè)計實驗豬有效的體外反搏裝置，參照臨床標(biāo)準療程，建立長期體外反搏動物模型，并測量計算血流動力學(xué)參數(shù)和剪切應(yīng)力。 3.觀察高脂血癥實驗豬動脈粥樣硬化病理形態(tài)學(xué)改變及長期EECP對高脂血癥豬動脈粥樣硬化病理形態(tài)的影響。 4.觀察高脂

3、血癥實驗豬血管內(nèi)皮形態(tài)與功能的變化，研究長期EECP對高脂血癥實驗豬血管內(nèi)皮形態(tài)與功能的影響，并檢測eNOS、Vcam-1表達的變化。 5.觀察高脂血癥實驗豬冠狀動脈血管重塑情況，研究長期EECP對高脂血癥實驗豬冠狀動脈血管重塑(內(nèi)膜增生)的影響，并探討MAPK、AKT/NF-κB信號途徑在其中的作用。 材料與方法 1.實驗分組與設(shè)計55頭雄性乳豬分四批隨機分為3組：1.正常對照組，飼以普通飼料15周；2.高脂對

4、照組，飼以高膽固醇飼料15周；3.高脂反搏組，同時同量飼以高膽固醇飼料15周，并在高脂飲食8周血脂升高后開始進行體外反搏干預(yù)，每次2小時，隔天1次，共反搏36小時。 2.血脂測量：于實驗起點、反搏前、反搏中期、反搏療程結(jié)束時抽取靜脈血檢測血清總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白變化。 3.EECP及血流動力學(xué)參數(shù)：EECP裝置由空氣壓縮機、檢測儀和氣囊組成，設(shè)置反搏氣囊充氣壓力為0.035Mpa/cm2。用彩色

5、多普勒超聲診斷儀測量反搏前、反搏中豬右肱動脈血流速度及內(nèi)徑等參數(shù)。頸動脈插管多導(dǎo)生理記錄儀測量有關(guān)血流動力學(xué)參數(shù)并同時抽血測量全血粘度。 4.實驗豬主動脈大體蘇丹Ⅲ脂肪染色標(biāo)本制作及檢測：主動脈中下段甲醛固定后，行蘇丹Щ脂肪染色，脂質(zhì)條紋及斑塊處呈典型橘紅色，攝像，用彩色圖像攝錄輸入儀和全自動圖像分析儀測定主動脈斑塊面積、內(nèi)膜總面積及其比值。 5.掃描電鏡、透射電鏡觀察冠狀動脈血管腔面超微結(jié)構(gòu)，6.組織形態(tài)學(xué)測量：取冠狀

6、動脈前降支開口以遠0.5cm處長約1cm血管段橫切成3-4小段，甲醛固定后常規(guī)包埋，制作蠟塊，繼而4-6μm厚橫截面切片行HE染色、醛品紅法彈力纖維染色、V-G膠原纖維染色及免疫組織化學(xué)檢查。 全自動圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜、部分中膜紅色V-G膠原染色陽性面積及總面積，求百分比，取平均值即為膠原纖維指數(shù)。 7.免疫組織化學(xué)檢查：上述冠脈前降支石蠟切片，采用SABC法或Elivision法檢測如下抗原在冠狀動脈中的表達：α-a

7、ctin抗體標(biāo)記血管平滑肌細胞，全自動圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜平滑肌細胞指數(shù)?？乖鲋臣毎丝乖?PCNA)抗體檢測處于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞和部分平滑肌細胞增殖，全自動圖像分析系統(tǒng)測量PCNA陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞比。 8.冠狀動脈石蠟切片免疫熒光激光共聚焦掃描檢測冠狀動脈NF-κB的蛋白表達水平。 9.收刮主動脈血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)行基因芯片檢測后RT-PCR檢測主動脈血管內(nèi)皮細胞VCAM-1mRNA表達水平。 10

8、.剪取主動脈弓組織提取蛋白行Western-blot檢測eNOS蛋白表達水平，phospho-ERK1/2/total-ERK1/2、phospho-p38MAPK/total-p38MAPK、phospho-AKT/total-AKT、phospho-NF-κB/total-NF-κB的蛋白表達情況。并采用actin作為內(nèi)參照。 結(jié)果： 1.通過高膽固醇喂飼成功建立了高脂血癥和早期動脈粥樣硬化模型。 2.成功建

9、立了長期EECP動物模型，達到了有效反搏的血流動力學(xué)指標(biāo)：指脈波監(jiān)測示典型舒張期增壓波，D/S比大于1.2。彩色多普勒超聲測量示反搏時血流速度明顯加快，經(jīng)計算反搏時舒張期血流剪切應(yīng)力峰值約為反搏前的兩倍。 3.高脂對照組主動脈大體標(biāo)本、冠狀動脈顯微鏡觀察均發(fā)現(xiàn)典型早期粥樣硬化病灶，高脂反搏組動脈粥樣硬化病理形態(tài)學(xué)改變減輕，主動脈斑塊/內(nèi)膜面積比顯著下降。 4.高脂對照組冠狀動脈內(nèi)皮形態(tài)發(fā)生改變，排列紊亂，高脂反搏組內(nèi)皮改

10、變明顯減輕，內(nèi)皮細胞趨向于沿血流方向平行排列，內(nèi)皮細胞形態(tài)指數(shù)顯著下降。高脂對照組伴隨著內(nèi)皮細胞的變性凋亡甚至脫落，eNOS免疫組化染色陽性面積及密度明顯減少，積分光密度比明顯較正常對照組下降，而高脂反搏組上述免疫組化改變減輕，積分光密度比較高脂對照組增高。 高脂對照組伴隨著斑塊的隆起和內(nèi)膜的增厚，VCAM-1染色陽性面積及密度明顯增高，積分光密度比明顯較正常對照組增高；而高脂反搏組內(nèi)膜中膜陽性染色明顯淺淡，積分光密度比較高脂對

11、照組顯著降低。 5.冠狀動脈血管重塑指標(biāo)分析示高脂血癥顯著誘發(fā)了高脂對照組實驗豬冠狀動脈內(nèi)膜增生及斑塊形成，內(nèi)/中膜面積比明顯增高；內(nèi)皮細胞和部分平滑肌細胞PCNA增殖指數(shù)增高，中膜平滑肌細胞大量增生，穿破內(nèi)彈力膜向內(nèi)膜遷移，內(nèi)膜平滑肌細胞指數(shù)較正常對照組明顯增高，膠原纖維在增厚的內(nèi)膜內(nèi)大量增生，膠原纖維染色陽性面積比比正常對照組顯著增高；但在高脂反搏組內(nèi)膜增生及斑塊形成得到一定程度的抑制：內(nèi)/中膜面積比顯著下降。內(nèi)皮細胞和部分

12、平滑肌細胞PCNA增殖指數(shù)降低，內(nèi)膜中平滑肌細胞指數(shù)較高脂對照組降低，由高脂血癥誘發(fā)的平滑肌細胞異常增殖和移行得到一定程度的抑制。 6.MAPK蛋白活性的變化：冠狀動脈免疫組化染色可見高脂對照組增厚的內(nèi)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的胞核內(nèi)大量表達phosph-ERK1/2蛋白，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總ERK1/2蛋白表達無明顯差異，磷酸化phospho-ERK1/2蛋白表達在高脂對照組

13、較正常對照組增高，故ERK1/2活性(磷酸化ERK1/2占總ERK1/2百分比)顯著增高。而高脂反搏組ERK1/2活性水平顯著低于高脂對照組，由高脂血癥誘發(fā)的ERK1/2活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 冠狀動脈免疫組化染色可見高脂對照組增厚的內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞和其下方的平滑肌細胞內(nèi)大量表達phospho-p38MAPK蛋白磷酸化，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總p38MAPK蛋白表達

14、無明顯差異，磷酸化phospho-p38MAPK蛋白表達在高脂對照組較正常對照組增高，故p38MAPK活性(磷酸化p38MAPK占總p38MAPK百分比)顯著增高。而高脂反搏組p38MAPK磷酸化活性水平顯著低于高脂對照組，說明由高脂血癥誘發(fā)的p38MAPK磷酸化活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 7.AKT蛋白活性水平的變化：冠狀動脈免疫組化染色可見高脂對照組增厚的內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞的胞核及胞漿內(nèi)明顯表達phosph-A

15、KT蛋白，內(nèi)皮下方的平滑肌細胞內(nèi)亦見表達，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總AKT蛋白表達無明顯差異，磷酸化phospho-AKT蛋白表達在高脂對照組較正常對照組增高，故AKT活性(磷酸化AKT占總AKT的百分比)顯著增高；而高脂反搏組AKT活性水平顯著低于高脂對照組，由高脂血癥誘發(fā)的AKT活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 8.phospho-NF-κBp65及NF-κBp65蛋白表

16、達水平的變化：免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測冠狀動脈NF-κBp65的表達：正常對照組血管壁NF-κBp65多呈無激活的靜息狀態(tài)，，主要存在于血管內(nèi)皮細胞的胞漿中，經(jīng)FITC標(biāo)記為綠色。高脂對照組斑塊處可見大量NF-κBp65表達于變大變圓的血管內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮下增生的平滑肌細胞的胞漿中，且活化易位入核，呈現(xiàn)紅色的核區(qū)中綠色熒光，疊加為黃色熒光。測定單位面積平均細胞核熒光強度顯著高于正常對照組；高脂反搏組內(nèi)皮細胞也可見一定程度的NF-κBp

17、65表達與激活，單位面積平均細胞核熒光強度明顯低于高脂對照組。 結(jié)論： 1.通過高膽固醇喂飼可成功建立實驗豬早期動脈粥樣硬化模型。 2.成功建立了長期EECP動物模型，采用新型設(shè)計囊套可在實驗豬身上達到理想的血流動力學(xué)效果。EECP可在生理范圍內(nèi)明顯提高在體脈動血流剪切應(yīng)力。 3.長期EECP可改善高脂血癥實驗豬動脈粥樣硬化病理形態(tài)。 4.長期EECP可改善高脂血癥實驗豬血管內(nèi)皮細胞形態(tài)與功能，其