C反應(yīng)蛋白和脂蛋白對人外周血單核細(xì)胞趨化蛋白-1及其受體表達(dá)的影響.pdf

1、冠心病已是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康、影響人們生活質(zhì)量的最常見心血管疾病之一。冠心病的發(fā)病機制尚不十分清楚，研究與冠心病相關(guān)的危險因素尤為重要。 目的: 1.觀察在不同濃度氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）、和不同濃度C反應(yīng)蛋白（CRP）刺激下人單核細(xì)胞MCP-1及其受體CCR2基因表達(dá)水平和MCP-1蛋白含量的變化情況，以明確CRP和Ox-LDL是否可以通過上調(diào)MCP-1/CCR2基因和蛋白表達(dá)來促進(jìn)單核細(xì)胞聚集； 2

2、.高密度脂蛋白（HDL）是否可以抑制CRP和Ox-LDL的此種作用，探討HDL抗AS作用的可能機制。 3.探討Ox-LDL、CRP、HDL與單核細(xì)胞MCP-1及CCR2表達(dá)之間可能存在的聯(lián)系以及在動脈粥樣硬化形成中的作用。 對象和方法: 1.對象 體外培養(yǎng)的人外周血來源的單核細(xì)胞。 2.方法 2.1 Ox-LDL的制備 采用改良的一次性密度梯度超速離心法從健康人新鮮血液分離出LDL

3、。將最終濃度調(diào)整至500mg/L。采用Cu2+誘導(dǎo)法對LDL進(jìn)行氧化，在濃度為100μmol/L的EDTA溶液中終止氧化。Bradford法測定蛋白含量。 2.2單核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 常規(guī)密度梯度離心法從人外周血分離獲得單個核細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，以5×105/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，置飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO237℃孵育箱中培養(yǎng)3天，加入不同濃度的Ox-LDL、CRP進(jìn)

4、行刺激，加入HDL觀察其對Ox-LDL、CRP的抑制作用。 2.3實驗分組每組3個復(fù)孔 2.3.1 Ox-LDL和CRP對單核細(xì)胞MCP-1和CCR2基因表達(dá)的影響 （1）對照組加入含磷酸鹽緩沖液（PBS）的等量1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞； （2）不同濃度Ox-LDL組：終濃度分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L的Ox-LDL與單核細(xì)胞孵育48小時； （3）不同濃度CRP組：濃度分別為3

5、mg/L、10mg/L、20mg/L的CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （4）提取細(xì)胞總RNA行RT-PCR檢測，每個培養(yǎng)孔提取2次細(xì)胞RNA送檢，即n=6。 2.3.2 Ox-LDL和CRP對單核細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的影響 （1）對照組：加入含磷酸鹽緩沖液（PBS）的等量1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞作為對照組； （2）不同濃度Ox-LDL組：終濃度分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L的Ox-LD

6、L與單核細(xì)胞孵育48小時； （3）不同濃度CRP組：濃度分別為3mg/L、10mg/L、20mg/L的CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （4）收集細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，每個培養(yǎng)孔提取3次細(xì)胞上清送檢，即n=9。 2.3.3 HDL對單核細(xì)胞MCP-1和CCR2基因表達(dá)以及MCP-1蛋白表達(dá)的影響 （1）對照組：加入含磷酸鹽緩沖液（PBS）的等量1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞作為對照組； （2）HD

7、L組：加入濃度為500mg/L HDL及1640培養(yǎng)基，提取細(xì)胞總RNA行RT-PCR檢測，每個培養(yǎng)孔提取2次細(xì)胞RNA送檢，即n=6；收集細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，每個培養(yǎng)孔提取3次細(xì)胞上清送檢，即n=9； 2.3.4 HDL對Ox-LDL、CRP介導(dǎo)單核細(xì)胞MCP-1和CCR2基因表達(dá)的影響 （1）不同濃度Ox-LDL對照組：終濃度分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L的Ox-LDL與單核細(xì)胞孵育48小時；

8、 （2）不同濃度CRP對照組：濃度分別為3mg/L、10mg/L、20mg/L的CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （3）不同濃度Ox-LDL與HDL共處理組：分別用500mg/L HDL+20mg/Lox-LDL、500mg/L HDL+40mg/L Ox-LDL、500mg/L HDL+80mg/L Ox-LDL與單核細(xì)胞孵育48小時； （4）不同濃度CRP組與HDL共處理組：分別用500mg/L HDL+3mg

9、/L CRP、500mg/L HDL+10mg/L CRP、500mg/L HDL+20mg/L CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （5）提取細(xì)胞總RNA行RT-PCR檢測，每個培養(yǎng)孔提取2次細(xì)胞RNA送檢，即n=6。 2.3.5 HDL對Ox-LDL、CRP介導(dǎo)單核細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的干預(yù)作用 （1）不同濃度Ox-LDL組：終濃度分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L的Ox-LDL與單核細(xì)胞孵育48小

10、時； （2）不同濃度CRP組：濃度分別為3mg/L、10mg/L、20mg/L的CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （3）不同濃度Ox-LDL與HDL共處理組：分別用500mg/L HDL+20mg/Lox-LDL、500mg/L HDL+40mg/L Ox-LDL、500mg/L HDL+80mg/L Ox-LDL與單核細(xì)胞孵育48小時； （4）不同濃度CRP組與HDL共處理組：分別用500mg/L HDL+3mg

11、/L CRP、500mg/L HDL+10mg/L CRP、500mg/L HDL+20mg/L CRP與單核細(xì)胞孵育48小時； （5）收集細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，每個培養(yǎng)孔提取3次細(xì)胞上清送檢，即n=9。 2.4.實時熒光定量RT-PCR法檢測MCP-1和CCR2 mRNA表達(dá) 提取細(xì)胞樣品總RNA，設(shè)計內(nèi)參β-actin和目的基因引物，采用RT-PCR擴增，同時加入熒光染料，通過檢測目的基因與內(nèi)參基因達(dá)到

12、熒光設(shè)定值所需循環(huán)數(shù)（Ct值）（△Ct）并對不同處理組目的基因的△Ct進(jìn)行比較，可對未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)做出判斷。 2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays，ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)液MCP-1蛋白含量，采用雙抗體夾心ELISA法。 3.統(tǒng)計學(xué)方法 RT-PCR結(jié)果（Act）和ELISA結(jié)果（ug/L）以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差齊性檢驗。方差齊（P>0.

13、10）則采用方差分析，方差不齊則采用Tamhane法校正。若方差分析結(jié)果提示各組間差異具有顯著性，則用Bonferroni法進(jìn)行組間多重比較。采用單因素方差分析分別對不同濃度Ox-LDL和不同濃度CRP的作用進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；采用兩樣本t檢驗對HDL對單核細(xì)胞MCP-1基因、蛋白和CCR2基因表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；采用兩因素方差分析對HDL的干預(yù)作用進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有統(tǒng)計學(xué)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。P<0.05表明有統(tǒng)計

14、學(xué)差異。 結(jié)果: 1.不同濃度Ox-LDL均可以促進(jìn)單核細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)（F=88.90，P=0.000）； 2.不同濃度Ox-LDL均可促進(jìn)單核細(xì)胞CCR2 mRNA的表達(dá)（F=129.25，P=0.000）； 3.3mg/L CRP對MCP-1 mRNA表達(dá)的影響不具有統(tǒng)計學(xué)意義，10mg/L、20mg/L CRP則可以促進(jìn)單核細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)（F=122.07，P=0.0

15、00）； 4.3mg/LCRP對CCR2 mRNA表達(dá)的影響也不具有統(tǒng)計學(xué)意義，而10mg/L、20mg/L CRP則可以促進(jìn)單核細(xì)胞CCR2 mRNA的表達(dá)（F=177.35，P=0.000）； 5.500mg/L的HDL對單核細(xì)胞MCP-1（t=0.01，P=0.992）和CCR2基因（t=-0.623，P=0.547）表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義； 6.500mg/L HDL可以抑制Ox-LDL促進(jìn)MCP-1和

16、CCR2 mRNA表達(dá)的作用： 7.500mg/L HDL可以抑制CRP對單核細(xì)胞MCP-1和CCR2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用； 8.各濃度的Ox-LDL均可以促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1； 9.10mg/L、20mg/L CRP均可以促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1； 10.500mg/L HDL對單核細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義； 11.500mg/L HDL可抑制Ox-LDL促進(jìn)MCP

17、-1蛋白表達(dá)的作用； 12.500mg/L HDL可抑制CRP促進(jìn)MCP-1蛋白表達(dá)的作用。 結(jié)論: 1.在體外，Ox-LDL和C反應(yīng)蛋白均可以促進(jìn)單核細(xì)胞MCP-1和CCR2 mRNA的表達(dá)和MCP-1的分泌，對炎癥反應(yīng)起著重要的推動作用； 2.HDL對單核細(xì)胞MCP-1/CCR2沒有直接作用，但可以抑制Ox-LDL、CRP上調(diào)MCP-1和CCR2基因表達(dá)的作用，這可能是HDL與AS發(fā)病呈負(fù)相關(guān)的機制之