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文檔簡介
1、牙齒的萌出依賴于牙囊的存在及牙槽骨的吸收,而其中單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊并在其中聚集是牙齒萌出的關(guān)鍵。牙齒萌出前,單核細(xì)胞遷入牙囊,并分化為破骨細(xì)胞吸收牙槽骨以形成牙齒的萌出通道。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是單核細(xì)胞遷入牙囊的主要趨化分子,其基因表達(dá)的高峰期位于大鼠出生后第三天,與單核細(xì)胞遷入牙囊的時期相一致。 表皮生長因子(EGF)是發(fā)現(xiàn)最早的生長因子之一,分布于人體多種組織中,在上皮的生長、分化、創(chuàng)傷的愈合過程中作用顯著。研
2、究表明,將EGF注射到新生小鼠體內(nèi)可以使切牙早熟性地萌出,因此EGF可能在牙齒萌出過程中發(fā)揮著重要的作用,但其具體的促萌機(jī)制尚不清楚。 本實驗擬在通過培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞,觀察表皮生長因子對牙囊細(xì)胞體外增殖的影響,并研究其與單核細(xì)胞趨化蛋白-1的關(guān)系,探討其在牙槽骨吸收過程中的作用,從而進(jìn)一步探討牙齒萌出的機(jī)理。 方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng):分離4~6天齡Wistar大鼠的牙囊組織,將組織塊放入a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)
3、胞生長至匯合點后傳代,取生長狀態(tài)良好的3~4代細(xì)胞待用。 2.檢測EGF對細(xì)胞增殖活性的影響:將生長良好的牙囊細(xì)胞以2×104個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后分別加入EGF(0.5、1、5、10、50ng/ml,與細(xì)胞共同孵育3~4天后,用MTT法對比觀察不同濃度的EGF對牙囊細(xì)胞增殖活性的影響。 3.檢測EGF對MCP-1表達(dá)的影響:將生長良好的牙囊細(xì)胞接種于直徑70mm的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長至匯合點后,用無血清的
4、a-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5h,再用10ng/ml濃度的EGF繼續(xù)孵育0、0.5、1、3、6h后終止培養(yǎng),Trizol一步法分別提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測同一濃度的EGF作用不同時間后,牙囊細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果: 1.牙囊組織培養(yǎng)24h后便可見少數(shù)細(xì)胞從組織周圍爬出,呈貼壁型生長,14~21天后細(xì)胞即可達(dá)單層匯合。細(xì)胞呈明顯的多形性,主要有兩種細(xì)胞形態(tài),一種細(xì)胞呈梭形,另一種
5、細(xì)胞呈多角形,兩種細(xì)胞間雜在一起生長。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性,表明細(xì)胞源自間充質(zhì)。 2.合適濃度的EGF對牙囊細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。在濃度為1ng/ml時開始顯效,5ng/ml時增高,10ng/ml時達(dá)到最高,與對照組比較有顯著差異。50ng/ml時增殖率開始降低,且與對照組無顯著性差異。 3.與10ng/ml EGF共同孵育0.5h,牙囊細(xì)胞中MCP-1mRNA表達(dá)開始升高,3
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